Étude du rôle du gène FLO11 et de son implication potentielle dans les propriétés pariétales et membranaires des levures

Study of the role of the gene FLO11 and its probable involvement in cell wall and membrane properties of yeasts

• Auteur / Autrice : Clara Bouyx
• Direction : Jean-Marie François, Marion Schiavone, Anne Ortiz-Julien
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 17/11/2021
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Carole Camarasa
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amparo Querol
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Hervé Alexandre, Florian Franz Bauer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Paroi cellulaire

Génétique

Extraction (oenologie)

Levure (agent de fermentation)

Mots clés libres

Levure

Oenologie

Génétique

Paroi cellulaire

Membrane

Yeast

Oenology

Genetic

Cell wall

Membrane

Résumé

En vinification, deux critères importants doivent être remplis par les levures assurant la transformation du moût de raisin en vin : démontrer une efficacité fermentaire et favoriser les caractéristiques organoleptiques du vin produit. Pour répondre au premier critère, ces levures peuvent être sélectionnées selon leur capacité à résister aux nombreux stress environnementaux et nutritionnels auxquels elles doivent faire face tout au long de la fermentation alcoolique. Par ailleurs, l’ajout de « dérivés de levures » industriels permet d’augmenter les capacités fermentaires des levures sèches actives avant inoculation du moût de raisin. La capacité à libérer des mannoprotéines et la teneur en stérols sont un critère de choix de ces levures destinées à être utilisées comme adjuvants de la vinification. C’est le cas de la souche S. cerevisiae L69 qui possède des propriétés pariétales originales dont notamment la formation de nanodomaines adhésifs (agrégats protéiques pouvant être dépliés sous l'effet d'une force physique externe) accompagnée par une quantité en mannoprotéines supérieure aux autres souches dont la souche de laboratoire BY4741, et qui présente une expression particulièrement élevée du gène FLO11 codant une Floculine (Schiavone et al., 2014 ; Schiavone et al., 2016).L’objectif général de cette thèse a donc été d’étudier le rôle du gène FLO11 et son implication potentielle dans les propriétés pariétales et membranaires de levures œnologiques, dont L69. La première partie de ma thèse a porté sur une analyse fonctionnelle de Flo11. Grâce l’utilisation de techniques de microscopies (AFM et immunofluorescence) combinées à des analyses bio-informatiques, nous avons montré pour la première fois que la protéine Flo11 de Saccharomyces cerevisiae est indispensable à la formation de nanodomaines adhésifs présents à la surface cellulaire et qu’un nombre seuil de motifs amyloïdes doit être présent dans la séquence protéique de Flo11. Ensuite, en utilisant une approche d'édition du génome, nous avons construit des souches exprimant des variants de cette protéine exprimés sous la dépendance du promoteur endogène FLO11, ce qui a conduit à montrer que la perte de séquences amyloïdes réduit fortement l'interaction cellule-cellule mais n'a aucun effet sur l'adhérence plastique ou la croissance invasive dans la gélose, les deux phénotypes étant par contre dépendants des extrémités N- et C-terminales de Flo11p. Enfin, cette étude a permis de montrer que la localisation de Flo11 n'est pas modifiée ni par l'absence de séquences formatrices d'amyloïdes ni par l'élimination des extrémités N- ou C-terminales de la protéine. Dans une seconde partie, les capacités fermentaires de la souche L69 en conditions œnologiques favorables et sous la contrainte de deux stress nutritionnels (carence azotée et absence de lipides) ont été évaluées. Cette étude a été réalisée par comparaison avec deux autres levures œnologiques de référence ECA5 et U43. Ces travaux ont montré que la souche L69 est bien plus résistante à l’accumulation d’éthanol et libère plus de mannoprotéines dans le milieu, et que ces deux caractéristiques sont respectivement impactées négativement ou positivement dans une souche défectueuse du gène FLO11. Nous avons noté aussi pour la première fois qu’une carence azotée favorise considérablement le relargage des mannoprotéines chez toutes les levures œnologiques que nous avons testées et que cette libération a lieu dès le début de la fermentation alcoolique. Enfin, nos travaux ont montré que le gène FLO11 semble impliqué dans la gestion et le stockage des lipides chez L69 et nous avons aussi mis en évidence que le procédé, en particulier le processus d’autolyse de levures pour générer des dérivés de levures impacte positivement la gestion des lipides.

In winemaking, there are two crucial criteria that are expected from yeasts accomplishing the transformation of grape must into wine :displaying great fermentation performances and promoting organoleptic qualities of the wine. Regarding the first criterion, these yeasts can be selected according to their capacity to resisting to the various environmental and nutritional stresses encountered during the alcoholic fermentation. To continue, it is known that the addition of industrial “yeast derivatives” before the inoculation of the must leads to an increase in the fermentation efficiency. In this case, the ability to release mannoproteins and sterols contents are two desired traits for these yeasts to be used as winemaking adjuvants. This is the case of the S.cerevisiae strain L69 which displays original cell wall properties like the formation of adhesive nanodomains (clustered proteins that can be unfolded under the application of an external shear force), greater mannoproteins contents compared to other strains (including the laboratory strain BY4741) and a huge expression of Flo11p-encoding gene (Schiavone et al., 2014 ; Schiavone et al., 2016).The global objective of this thesis was therefore to study the role of FLO11 and its probable involvement in the cell wall and membrane properties of wine yeasts, including L69. The first part of my thesis dealt with the functional analysis of Flo11p. Microscopy techniques (AFM and immunofluorescence) combined with bioinformatics analyses showed for the first time that Flo11p from Saccharomyces cerevisiae is necessary for the formation of adhesive nanodomains at the cell surface, and that this phenotype requires a minimum threshold of amyloid-prone sequences in the amino acid sequence of Flo11p. Then, using a genome editing approach, we constructed strains expressing variants of the Flo11 protein under the endogenous FLO11 promoter, leading to the demonstration that the loss of amyloid-forming sequences strongly reduces cell-cell interaction but has no effect on either plastic adherence or invasive growth in agar, both phenotypes being dependent on the N- and C-terminal ends of Flo11p. Finally, we show that the location of Flo11 is not altered either by the absence of amyloid-forming sequences or by the removal of the N- or C-terminus of the protein.In the second part of my thesis, we evaluated the fermentation performances of the strain L69 in friendly oenological conditions or under two nutritional stresses (nitrogen deficiency and lipids depletion). The two well characterized wine yeast strains ECA5 and U43 were also tested as controls. This work showed that the strain L69 is more resistant to the accumulation of ethanol and releases more mannoproteins in the medium, and that these two characteristics are respectively negatively or positively impacted by the deletion of FLO11. We also noted for the first time that a nitrogen deficiency remarkably enhances the release of mannoproteins by all the wine yeasts tested here and that this release occurs from the very beginning of the alcoholic fermentation.In the last part of my thesis, we showed that the FLO11 gene seemed to be involved in the management of lipids in L69. We also highlighted that the process, and particularly the autolysis process, for the production of yeast derivatives positively impacts the management of lipids.