Propriétés probiotiques de levures non-Saccharomyces à activités antibactériennes et étude du mycobiote de vaches laitières

Probiotic properties of non-Saccharomyces yeasts with antibacterial activity and study of mycobiota from dairy cows

• Auteur / Autrice : Ali Sadek
• Direction : Djamel Drider
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies agroalimentaires, sciences de l'aliment, physiologie
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Lille ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : UMR Transfrontalière BioEcoAgro
• Partenaire(s) de recherche : Entreprise : Lallemand S. A. (Toulouse, France)
• Jury : Président / Présidente : Rozenn Ravallec
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Masneuf, Françoise Coucheney, Frédérique Chaucheyras-Durand, Mathieu Castex
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ismail Fliss, Yves Millemann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage à haut débit

Antibactériens

Lutte contre

Bactéries pathogènes

Probiotiques

Levures (botanique)

Alimentation

Vaches laitières

Panse -- Microbiologie

Microflore

Mots clés libres

Levures non-Saccharomyces

Metschnikowia pulcherrima

Non-Saccharomyces yeasts

Mycobiota

Ruminant

Probiotic

Antibacterial activity

Résumé

Le premier objectif de cette thèse est d'étudier la composante fongique du microbiote des ruminants, en particulier celui des vaches laitières. Pour cela, le mycobiote intestinal de vaches laitières a été ciblé selon deux régimes alimentaires saisonniers différents, un régime hivernal et un régime estival, permettant de mettre en évidence l'impact de l'alimentation et de la saison sur le mycobiote intestinal. L'analyse de la beta-diversité a montré un mycobiote différent selon le type d'alimentation. En effet, les vaches ont reçu une alimentation estivale en pâturage et une alimentation hivernale qui est composée de foins, d'ensilage de maïs et d'herbe et de concentré de production. Les indices d'alpha-diversité (Simpson inverse, Chao1, uniformité de Simpson) démontrent une plus grande richesse, une diversité et une uniformité du mycobiote avec l'alimentation estivale, et une chute de ces mêmes paramètres lors de l'alimentation hivernale. Dans notre analyse, nous avons remarqué que le genre Geotrichum est présent chez tous les ruminants de cette étude en hiver et compose la majorité du mycobiote (abondance relative moyenne de 65%). Une seconde étude a permis de mettre en évidence un mycobiote composé d'une unité taxonomique opérationnelle (OTU) appartenant à la famille des Dipodascaceae, présente dans tous les compartiments du tractus gastrointestinal (rumen, colon, rectum). L'OTU n'a pas pu être identifiée plus profondément, mais il est à noter que le genre Geotrichum appartient à la famille Dipodascaceae. L'analyse de la beta-diversité de ces mêmes échantillons a été réalisée, après extraction de l'ADN avec 3 kits (MN, ZQ et ZM) et l'analyse des profils mycobiotiques a pu mettre en évidence des différences entre le profil obtenu en utilisant l'ADN extrait avec un kit commercial recommandé pour les analyses des microbiotes (ZM), et les profils obtenus avec les deux autres kits (MN et ZQ). Le deuxième objectif de cette thèse porte sur la recherche de levures non-Saccharomyces comme souches probiotiques pour les ruminants. Le criblage d'une collection de 431 levures non-Saccharomyces pour leurs propriétés inhibitrices contre des bactéries à Gram-positif et à Gram négatif a permis de montrer que 71 souches ont au moins une activité inhibitrice contre une de ces cibles. Toutefois, pour la suite de cette thèse, 6 levures non- Saccharomyces ont été sélectionnées : ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 et ICVY064, en raison de leur spectre d'activité in vitro contre des pathogènes du ruminant, en conditions aérobie et anaérobie à 30°C et 39°C. A noter que deux souches ICVY060 et LAN55 ont montré le plus large spectre d'activité contre toutes les bactéries cibles. Enfin, ces 6 souches se sont avérées être non cytotoxiques, non hémolytiques, sensibles aux principaux antifongiques utilisés en clinique et survivent relativement mieux in vitro que le probiotique Saccharomyces cerevisiae CNCM-I-1077 dans des conditions mimant l'abomasum. D'autres tests tels que les propriétés de surface, ou encore leur impact sur l'expression des gènes codant les protéines de jonctions cellulaires intestinales ont été réalisés.

The first objective of this thesis was to study the fungal component of ruminant microbiota, particularly in dairy cows. To this end, we targeted the intestinal mycobiota of dairy cows differently fed and considering also the impact of the seasonality. Therefore, the analysis of beta-diversity showed a different mycobiota, depending on the type of feed received. The cows were fed with a summer pasture diet and a winter diet constituted of hay, corn and grass silage and production concentrate. The alpha diversity indices (Simpson inverse, Chao1, Simpson uniformity) unveiled a greater richness, diversity and uniformity of mycobiota with summer feeding, and a noticeable decrease in these parameters with winter feeding. In our analysis, we found that Geotrichum genus was present in all ruminants in this study in winter, leading to the highest relative abundance 65%. A second study revealed a mycobiota composed of an operational taxonomic unit (OTU) belonging to the Dipodascaceae family and present in all compartments of the gastrointestinal tract (rumen, colon, rectum). The OTU could not be further identified, but it should be noted that the Geotrichum genus belongs to the Dipodascaceae family. Analysis of the beta-diversity of these same samples was carried out after DNA extraction using 3 different kits, and analysis of the mycobiotic profiles revealed differences between the profile obtained using DNA extracted with a commercial kit recommended for microbiota analysis (ZM), and the profiles obtained with the other two kits (MN and ZQ). The second objective was to screen and characterize a collection of non-Saccharomyces yeasts for their probiotic trends and design a potential application in the animal production, particularly in ruminants. Following a screening of a collection of 431 non-Saccharomyces yeasts for their inhibitory activity against Gram-positive target bacteria and Gram-negative bacteria, 71 strains showed inhibitory activity against at least one of the target bacteria. Nonetheless, we considered 6 non-Saccharomyces yeasts (ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 and ICVY064) due to their spectrum of activity in vitro against ruminant pathogens, under both aerobic and anaerobic conditions and prevailing temperatures of 30°C and 39°C. Two strains, ICVY060 and LAN55, showed the broadest spectrum of activity by inhibiting all targeted bacteria. Of note, these strains were characterized for their resistance to conditions mimicking those prevailing in the animal abomasum and intestine compartments, with better survival rate in the in vitro abomasum conditions. Finally, all these strains resulted to be safe as non-cytotoxic, non-hemolytic activity was registered and were also sensitive to the main antifungal agents of clinical use. Further analyses, such as their surface properties or their impact on membrane integrity by studying the expression of genes encoding cell junction proteins were established.