Optimization of the glycerol bioconversion into 3-hydroxypropionic acid (3-HP) by Lactobacillus reuteri in bioreactor

par Thi Lan Phuong Nguyen

Thèse de doctorat en Biotechnologies

Sous la direction de Catherine Béal.

Soutenue le 18-03-2021

à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....) , en partenariat avec AgroParisTech (France ; 2007-....) (référent) et de Paris-Saclay Food and Bioproduct Engineering (Massy, Essonne ; 2020-....) (laboratoire) .

Le président du jury était Stéphane Delaunay.

Le jury était composé de Stéphane Delaunay, Djamel Drider, Claire Saulou, Dominique Grizeau, Wafa Guiga.

Les rapporteurs étaient Stéphane Delaunay, Djamel Drider.

mots clés

• Acide 3-Hydroxypropionique
• Lactobacillus reuteri
• Plan d’expériences
• Bioconversion du glycérol
• Fed-Batch
• Lactobacilles -- Aspect moléculaire
• Procédés discontinus

Titre traduit

Optimisation de la bioconversion du glycérol en acide 3-hydroxypropionique (3-HP) par Lactobacillus reuteri en bioréacteur

Résumé

L’acide-hydroxypropionique (3-HP) est une molécule "plateforme" dont la production par voie biologique implique la bactérie Lactobacillus reuteri, selon un procédé en deux étapes : une croissance sur glucose en mode "batch" et une bioconversion du glycérol en 3-HP en mode "fed-batch". Dans le but d’améliorer la production de 3-HP, la thèse a pour objectifs (1) d’identifier les conditions nutritionnelles et environnementales mises en œuvre lors de la croissance permettant d’améliorer la production ultérieure du 3-HP et (2) de rechercher les conditions opératoires de la phase de bioconversion permettant d’augmenter les performances de production. Les conditions de croissance affectant la production de la biomolécule ont été déterminées grâce à un plan d’expériences de Plackett et Burman impliquant 11 facteurs. La supplémentation du milieu de croissance avec de la vitamine B12 et de la cystéine a montré un effet négatif sur la production ultérieure de 3-HP. L’addition de glucose, phytone peptone, Tween 80, 1,2-propanediol et bétaïne dans le milieu de culture, associée à un pH optimal de 6,0 pendant la croissance ont permis d’accroître la production de 3-HP et la durée de la bioconversion. L’ajout d’extrait de levure et le type de neutralisant utilisé n’ont démontré aucun effet. Néanmoins, les résultats ayant été obtenus à un débit d’alimentation en glycérol fixé à 0,5 g·h-1, l’amélioration s’est trouvée limitée. Les conditions de la bioconversion ont alors été étudiées selon un plan composite centré isovariant par rotation qui a permis de tester différents niveaux de pH et de vitesse spécifique d’alimentation en glycérol. Par l’établissement de surfaces de réponses, des conditions optimales, différentes selon la variable considérée (concentrations, rendements, vitesses), ont été identifiées. Des essais de validation ont permis de vérifier la pertinence des conditions retenues, avec une amélioration significative de la productivité du bioprocédé de 96 %. Finalement, le pH et le niveau d’énergie intracellulaires sont proposés comme des marqueurs de la dégradation des capacités de production de 3-HP.

mots clés

• 3-Hydroxypropionic acid
• Lactobacillus reuteri
• Experimental designs
• Glycerol bioconversion
• Fed-Batch

Résumé

3-Hydroxypropionic acid (3-HP) is a platform molecule whose biological production involves the bacterium Lactobacillus reuteri, according to a two-step process: a growth phase in batch mode on glucose, then a glycerol bioconversion into 3-HP in fed-batch mode. With the objective of improving the 3-HP bioproduction, the thesis aims at (1) identifying the nutritional and environmental conditions implemented during the growth phase to improve the subsequent production of 3-HP and (2) searching the operating conditions during the bioconversion phase that increase the 3-HP bioproduction performance. Growth conditions that influence the subsequent 3-HP production were determined using a Plackett and Burman experimental design involving 11 factors. Supplementing the growth medium with vitamin B12 and cysteine showed a negative effect on this subsequent production. The addition of glucose, phytone peptone, Tween 80, 1,2-propanediol and betaine to the culture medium, combined with an optimal pH of 6 during growth, enhanced the subsequent production of 3-HP and the bioconversion duration. The addition of yeast extract and the type of neutralizer showed no significant effect. However, since these results were obtained at a glycerol feeding rate value set at 0.5 g h-1, the process improvement was limited. The bioconversion conditions were then studied according to a central composite rotatable design that allowed testing various pH levels and specific glycerol feeding rates. By establishing response surfaces, optimal conditions have been identified, that were different depending on the considered variable (concentrations, yields, rates). Additional validation experiments made it possible to verify the relevance of the selected conditions, with a significant improvement of the bioprocess productivity by 96 %. Finally, intracellular pH and energy level were proposed to explain the degradation of 3-HP production ability.