Etude des facteurs génétiques impliqués dans la sécrétion d'enzymes chez les souches hyperproductrices de Trichoderma reesei

Study of genetic factors involved in enzyme secretion in hyperproductive strains of Trichoderma reesei

• Auteur / Autrice : Jawad Alharake
• Direction : Antoine Margeot, Senta Heiss-Blanquet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 23/11/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IFP Energies Nouvelles
• Partenaire(s) de recherche : référent : AgroParisTech (France ; 2007-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Fudal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Marie François, Marie-Noëlle Rosso, Isabelle Benoit Gelber, Sylvain Brun
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Marie François, Marie-Noëlle Rosso

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sécrétion

Cellulase

Analyse

Transcriptome

Innovation

Trichoderma reesei

Recherche

Biocarburants

Mots clés libres

Biocarburants

Champignons

Trichoderma reesei

Cellulases

Sécrétion

Stress de sécrétion

Biofuels

Fungi

Trichoderma reesei

Cellulases

Secretion

Secretion stress

Résumé

Les combustibles fossiles sont un contributeur majeur au réchauffement climatique, et leur nature non renouvelable est un obstacle à la construction de sociétés durables. Dans ce contexte, les biocarburants de seconde génération se présentent comme une alternative attractive et plus respectueuse de l'environnement. Le processus de production de biocarburants de deuxième génération comprend plusieurs étapes incluant le prétraitement physico-chimique de la biomasse lignocellulosique (non comestible), l'hydrolyse enzymatique de la cellulose en glucose et par la fermentation de sucres simples en biocarburants, comme le bioéthanol. Un des problèmes principaux pour une large application est cependant le coût relativement élevé des enzymes hydrolytiques, les cellulases, utilisées pour déconstruire la biomasse lignocellulosique prétraitée en sucres fermentescibles.Le champignon filamenteux Trichoderma reesei est le choix privilégié pour la production industrielle de cellulases car il possède des capacités d'hyperproduction et d'hypersécrétion. Les souches industrielles de T. reesei peuvent sécréter jusqu'à 100 g/L de cellulases dans des fermenteurs industriels contrôlés. En particulier, la souche mutante Rut-C30 est une souche hyperproductrice de référence, mais notre compréhension incomplète de son système de sécrétion performant complique l'amélioration de sa capacité d'hypersécrétion par génie génétique. C'est pourquoi, ce travail visait à éclaircir les voies de régulation contrôlant la sécrétion et les réponses au stress de sécrétion pour identifier des goulots d'étranglement et pour développer de nouvelles souches dotées d'une capacité de sécrétion supérieure dans le futur.Dans ce but, des données transcriptomiques étaient générées à partir de cultures de T. reesei Rut-C30 dans différentes conditions de stress de sécrétion et ont permis d'identifier de composants potentiels de régulation de la sécrétion qui pouvaient être ciblés pour invalidation. Pour compléter cette approche, un datamining de données transcriptomiques obtenues avec d'autres champignons filamenteux cultivés dans des conditions de stress de sécrétion a révélé d'autres gènes cibles potentiellement impliqués dans la régulation de la voie de sécrétion. Finalement, neuf gènes ont été invalidés dans la souche Rut-C30 et les mutants obtenus ont été caractérisés phénotypiquement. Tous ont montré une croissance ralentie et un comportement de sécrétion altéré. Un séquençage de l'ARN a été réalisé sur les mutants ∆res2, ∆rpn4 and ∆snd1 et comparé à celui de Rut-C30 dans les mêmes conditions de culture. Aucun des trois facteurs de transcription n'impacte la transcription des gènes impliqués dans la sécrétion ou dans la réponse au stress de sécrétion dans nos conditions. En revanche, des gènes codant pour des enzymes du métabolisme des lipides sont différentiellement exprimés dans les trois mutants ce qui pourrait affecter la sécrétion indirectement. Les résultats délivrent des premiers indices pour atténuer les goulots d'étranglement de la sécrétion dans T. reesei Rut-C30 et ouvrent la voie vers le développement de souches possédant une capacité de sécrétion améliorée.

Fossil fuels are a major contributor to global warming, and their non-renewable nature is an impediment for building sustainable societies. In this context, second generation biofuels represent an attractive and more environmentally friendly alternative. The process of second-generation biofuel production consists of several steps including a physicochemical pretreatment of lignocellulosic (non-edible) biomass, the enzymatic hydrolysis of cellulose into glucose and the fermentation of simple sugars into biofuels, such as bioethanol. One of the main bottlenecks for a large implementation of this process is, however, the relatively high cost of hydrolytic enzymes, namely cellulases, used to deconstruct the pretreated lignocellulosic biomass into fermentable sugars.The filamentous fungus Trichoderma reesei is the preferred choice for industrial production of cellulases since it has hyperproduction and hypersecretion capacities. Industrial strains of T. reesei can secrete up to 100 g/L of cellulases in controlled industrial fermenters. In particular, the mutant strain Rut- C30 is a reference hyperproducer strain, but our incomplete understanding of its enhanced secretion system complicates further improvement of its hypersecretion capacity by genetic engineering. Therefore, this work aimed at unravelling the regulatory pathways controlling secretion and the secretion stress response in order to identify bottlenecks and to develop new strains with enhanced secretion capacity in the future.To this end, transcriptomic data were generated from cultivations of T. reesei Rut-C30 in different secretion stress conditions which allowed to identify potential components of secretion regulation that were targeted for deletion. As a complementary approach, mining of transcriptomic data obtained with other filamentous fungi in secretion stress conditions revealed further target genes potentially involved in the regulation of the secretion pathway. Finally, nine genes were deleted in the Rut-C30 strain, and the resulting strains phenotypically characterized. All of them displayed reduced growth and showed altered protein secretion behavior. RNA sequencing was performed on ∆res2, ∆rpn4 and ∆snd1 mutant strains and compared to that of Rut-C30 in the same culture conditions. Neither of the three transcription factors impacts transcription of genes involved in secretion or the secretion stress response in our conditions. However, in all three mutants, genes encoding enzymes of lipid metabolism are differentially expressed which could affect secretion in an indirect way. The results represent first clues to alleviate bottlenecks in secretion in T. reesei Rut-C30 and pave the way to develop strains with still improved secretion capacity.