Étude de la diversité catalytique des enzymes à radical SAM impliquées dans les modifications post-traductionnelles.

Catalytic diversity of SAM radical enzymes involved in post-translational modifications

• Auteur / Autrice : Thibaut Bourdin
• Direction : Olivier Berteau, Alhosna Benjdia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 07/11/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas) - MICrobiologie de l'ALImentation au Service de la Santé / MICALIS
• Partenaire(s) de recherche : Référent : AgroParisTech (France ; 2007-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Avenier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Julie Hardouin, Yanyan Li, Muriel Gondry
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julie Hardouin, Yanyan Li

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cyanocobalamine

Métalloenzymes

Mots clés libres

Enzymes à radical SAM

Modifications post-Traductionnelles

Méthanogenèse

RiPPs

Sactipeptides

Radical SAM enzymes

Post-Transnational modifications

Methanogenesis

RiPPs

Sactipeptides

Résumé

Les enzymes à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM), constituent une superfamille majeure d'enzymes intervenant dans de nombreux processus biologiques essentiels du vivant. Ces enzymes utilisent la chimie radicalaire pour catalyser une grande diversité de modifications biochimiques non conventionnelles sur différents types de molécules, notamment des métabolites secondaires, l'ADN ou l'ARN ainsi que sur les protéines et peptides. Pour catalyser ces réactions uniques, ces enzymes emploient un centre métallique [4Fe-4S] radical SAM, ainsi qu'un cofacteur, la S-adénosyl-L-méthionine (SAM), qui se lie à celui-ci. La réduction de ce centre induit le clivage homolytique de la SAM et la formation d'un intermédiaire radicalaire 5'-deoxyadenosyl, indispensable à l'activité de ces enzymes.L'une des plus grandes familles d'enzymes à radical SAM, est la famille des enzymes à radical SAM dépendantes de la vitamine B12 (cobalamine). Cette famille émergente catalyse diverses réactions biochimiques complexes incluant principalement des réactions de méthylations sur des atomes de carbone inactifs chimiquement. Ces enzymes, comme les autres membres de cette superfamille, utilisent la chimie radicalaire pour le clivage de la SAM mais aussi la méthylcobalamine comme accepteur et donneur de groupements méthyles. Néanmoins, le mécanisme de ces enzymes reste encore largement mal compris. Récemment, la glutamine C‐méthyltransférase (QCMT), une nouvelle enzyme appartenant à ce groupe a été décrite comme catalysant la méthylation d'un résidu de glutamine dans le site actif de la méthyl-coenzyme M réductase (MCR), un complexe enzymatique jouant un rôle majeur dans la méthanogenèse.L'un des objectifs de ma thèse a consisté à déterminer le mécanisme et la structure de cette nouvelle enzyme. Nous avons notamment montré que QCMT est non seulement capable de catalyser in vitro la méthylation d'une glutamine sur son atome de carbone Cα, mais également l'épimérisation de ce résidu. En outre, QCMT catalyse également la méthylation d'un grand nombre d'acides aminés, comprenant la conversion directe d'une Gly en D-Ala sur un peptide mimant la séquence de MCR. L'étude structurale de cette enzyme nous a permis de montrer qu'en solution, des changements conformationnels ont lieu lors de la liaison de la cobalamine. Grâce à une étude par cristallographie, nous avons également résolu une structure de cette enzyme et proposé un modèle structural.Le second groupe majeur d'enzymes à radical SAM est celui des enzymes possédant un domaine SPASM, leur permettant de coordonner, en plus du centre radical SAM, d'autres centres [4Fe-4S] auxiliaires. La grande majorité de ces enzymes catalyse des MPTs sur des peptides de la famille des RiPPs (Ribosomally-Synthesized and Post-translationally-modified Peptides). Les RiPPs appartiennent à une famille majeure de produits naturels possédants de multiples fonctions biologiques, dont par exemple des activités antibiotiques ou encore anti-cancéreuses, faisant de ces molécules des composés d'intérêt dans le domaine de la santé. La biosynthèse des RiPPs débute généralement par la traduction d'un peptide précurseur qui va ensuite subir diverses MPTs catalysées par des enzymes de maturation, dont font partie les enzymes à radical SAM à domaine SPASM.Afin de mieux comprendre les mécanismes et fonctions de ces enzymes, j'ai étudié la biosynthèse d'un peptide RiPPs, la ruminococcine C. L'enzyme de maturation de ce peptide (MC2), catalyse la formation de quatre ponts α-thioéthers, conférant à la ruminococcine C sa structure en double épingle à cheveux et son activité contre Clostridium perfringens. En particulier, je me suis intéressé au rôle des centres [4Fe-4S] auxiliaires chez cette enzyme dans la formation des ponts α-thioéthers. Nous avons ainsi caractérisé par spectroscopie RPE les trois centres [4Fe-4S] de cette enzyme et avons montré que le centre auxiliaire II pourrait jouer un rôle rédox dans le mécanisme de l'enzyme.

S-adenosyl-L-methionine (SAM) radical enzymes are a major superfamily of enzymes involved in many of life's essential biological processes. These enzymes use radical chemistry to catalyze a wide variety of unconventional biochemical modifications on different types of molecules, including secondary metabolites, DNA or RNA, as well as proteins and peptides. To catalyze these unique reactions, these enzymes require a [4Fe-4S] radical SAM cluster, as well as a cofactor, S-adenosyl-L-methionine (SAM), which binds to the SAM radical cluster. One electron reduction of this center induces homolytic cleavage of SAM and the formation of a radical intermediate, the 5'-deoxyadenosyl radical, which is essential for the activity of these enzymes.One of the largest families of radical SAM enzymes is the family of B12 vitamin (cobalamin)-dependent radical SAM enzymes. This emerging family catalyzes a variety of complex biochemical reactions, including mainly methylation reactions on chemically inactive carbon atoms. These enzymes, like the other members of this superfamily, use radical chemistry for SAM cleavage, but also methylcobalamin as acceptor and donor of methyl groups. Nevertheless, the mechanism of these enzymes remains largely poorly understood. Recently, glutamine C-methyltransferase (QCMT), a new enzyme belonging to this group, was described as catalyzing the methylation of a glutamine residue in the active site of methyl-coenzyme M reductase (MCR), an enzyme complex playing a major role in methanogenesis.One of the objectives of my thesis was to determine the enzymatic mechanism and structure of this new enzyme. In particular, we have shown that QCMT is not only able to catalyze in vitro the methylation of a glutamine on its Cα carbon atom, but also the epimerization of this residue. In addition, QCMT also catalyzes the methylation of a large number of amino acid residues, including the direct conversion of a Gly to D-Ala on a peptide mimicking the MCR sequence. The structural study of this enzyme enabled us to show that, in solution, conformational changes take place during cobalamin binding. Thanks to a crystallographic study, we have also solved the structure of this enzyme, and proposed a structural model.The second major group of radical SAM enzymes are those containing a SPASM domain, allowing them to coordinate other [4Fe-4S] auxiliary clusters in addition to the radical SAM cluster. The vast majority of these enzymes catalyze MPTs on peptides of the RiPPs (Ribosomally-Synthesized and Post-translationally-modified Peptides) family. RiPPs represent a major family of natural products with multiple biological functions, including antibiotic, toxin and anti-cancer activities, making these molecules of interest in the healthcare field. The biosynthesis of RiPPs generally begins with the translation of a precursor peptide, which then undergoes various MPTs catalyzed by maturation enzymes, including radical SAM enzymes with SPASM domains.To better understand the mechanisms and functions of these enzymes, I studied the biosynthesis of a peptide belonging to the RiPPs family, produced by the human microbiota, ruminococcin C. The maturation enzyme for this peptide (MC2) catalyzes the formation of four α-thioether bonds, giving ruminococcin C its double hairpin structure and its activity against Clostridium perfringens, a Gram-positive human pathogen. In particular, I investigated the role of [4Fe-4S] auxiliary clusters in this enzyme in the formation of α-thioether bonds. Using EPR spectroscopy, we characterized the three [4Fe-4S] clusters of this enzyme and showed that auxiliary center II could play a redox role in the enzyme's enzymatic mechanism.