Décrypter les mécanismes d'adaptation au froid de Listeria monocytogenes en présence de lipides insaturés alimentaires

Deciphering the mechanisms of cold adaptation when Listeria monocytogenes uses food-unsaturated lipid

• Auteur / Autrice : Aurore Quilleré
• Direction : Florence Dubois-Brissonnet, Maud Darsonval
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 03/10/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine
• Partenaire(s) de recherche : Référent : AgroParisTech
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Pascal Piveteau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nabila Haddad, Michel Hébraud, Nadia Oulahal
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nabila Haddad, Michel Hébraud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lipides

Transcriptome

Listeria monocytogenes

Résistance au froid

Mots clés libres

Listeria

Surcroissance

Acides gras exogènes

Basse température

Analyse transcriptomique

Composition membranaire

Listeria

Overgrowth

Exogenous fatty acid

Low temperature

Transcriptome analysis

Membrane composition

Résumé

Les pathologies infectieuses d'origine alimentaire, en particulier les listérioses avec leur fort taux de létalité, demeurent un véritable problème de santé publique. Ubiquitaire et psychrotrophe, Listeria monocytogenes est fréquemment présente dans les environnements alimentaires (matières premières, chaîne de production), et peut contaminer de nombreuses denrées, telles que les produits prêt à consommer. Pour cette catégorie de produits, la réfrigération est la principale méthode permettant de maitriser la croissance du pathogène et de garantir la sécurité sanitaire du produit. Une étude préliminaire de l'équipe a montré que plusieurs souches de L. monocytogenes sont capables d'incorporer des acides gras exogènes dans leur membrane, ce qui provoque un changement dans leur capacité de croissance à basse température. En effet, les acides gras saturés (AGS) limitent la croissance, alors que les acides gras insaturés (AGI) la favorisent. La tendance actuelle visant à privilégier les AGI dans les aliments au détriment des AGS pour répondre à des recommandations nutritionnelles pourrait donc augmenter le risque de listériose des produits réfrigérés riches en lipides.Dans ce contexte, le but de ce travail était de mieux comprendre le comportement de L. monocytogenes à basse température dans des environnements riches en acides gras. Dans un premier temps, nous avons caractérisé, génotypiquement et phénotypiquement, la souche Lm208 qui présentait le taux de croissance le plus important à basse température en présence d'acide oléique dans l'étude préliminaire. Le génome a été séquencé, annoté, et enrichi. Nous avons ensuite complété l'étude phénotypique en évaluant la réponse de L. monocytogenes à différents acides gras en fonction de leur structure (longueur de chaîne, insaturations). Les AGI induisant, après incorporation, une température de fusion des phospholipides membranaires comprise entre 18 et 23°C (AGI à 18 carbones) permettent la plus importante augmentation de croissance de Lm208 à basse température.Dans un deuxième temps, nous avons mené des études transcriptomiques non ciblée et ciblée pour mettre en évidence l'expression de gènes en relation avec le phénotype étudié. L'analyse RNA seq globale sur quatre conditions (croissance avec ou sans supplémentation en acide oléique à 5°C et 37°C) a permis de sélectionner les gènes impliqués dans ce phénomène de surcroissance. Une analyse par RT qPCR a ensuite été conduite sur les gènes ciblés en élargissant le panel des conditions de culture testées. Parmi les gènes d'intérêt, fabK impliqué dans la voie de biosynthèse des acides gras, cheY et flaA impliqués dans la mobilité et l'assemblage des flagelles sont respectivement sur exprimés ou sous exprimés en présence d'AGI ou AGS. L'expression différentielle de fabK pourrait avoir un lien avec la régulation de la voie de biosynthèse des AGI versus AGS. La présence de flagelles très longs et nombreux en présence d'AGI à basse température a été confirmée par microscopie électronique à transmission. Ce phénotype remarquable pourrait avoir des conséquences sur la capacité de L. monocytogenes à former des biofilms et à persister dans les environnements de production.En conclusion, ce travail a confirmé l'effet promoteur de croissance de nombreux AGI sur L. monocytogenes à basse température, et a mis en évidence un phénotype associé correspondant à la synthèse de flagelles longs et nombreux, ce qui peut avoir d'importantes conséquences en termes de sécurité sanitaire des aliments riches en lipides et des environnements de production associés.

Food-borne infectious diseases, especially listeriosis with its high case fatality rate, remain a real public health problem. Being ubiquitous and psychrotrophic, Listeria monocytogenes is frequently found in food environments (raw materials, production chain), and can contaminate numerous foodstuffs, such as ready to eat products (RTE). For RTE products, refrigeration is the main method for controlling pathogen growth and guaranteeing product food safety. A previous study performed in our laboratory showed that several strains of L. monocytogenes can incorporate exogenous fatty acids into their membranes, modifying their ability to grow at low temperature. Saturated fatty acids (SFA) limit growth, while unsaturated fatty acids (UFA) promote it. This ability could question new trends in reformulating food with unsaturated fatty acids to fit with nutritional claims that could increase the risk of listeriosis in lipid-rich refrigerated products.In this context, this work aimed at understanding the behavior of L. monocytogenes at low temperatures in fatty acid rich environments. First, we characterized, genotypically and phenotypically, Lm208, the strain that has shown the highest growth rate at low temperatures in the presence of oleic acid in the preliminary study. The genome was sequenced, annotated, and enriched. We then completed the phenotypic characterization by evaluating the behavior of L. monocytogenes in the presence of different FAs according to their structure (chain length, unsaturation). UFAs inducing, after incorporation, a membrane phospholipid melting temperature between 18 and 23°C (18 carbon UFA) enabled the greatest increase in Lm208 growth at low temperature.Secondly, we performed non targeted and targeted transcriptomic studies to study the gene expression related to the observed phenotype. Global RNA seq analysis over four conditions (growth with or without oleic acid supplementation at 5°C and 37°C) enabled us to select the genes involved in this overgrowth phenomenon. RT qPCR analysis was then carried out on the targeted genes, enlarging the range of culture conditions tested. Among the genes of interest, fabK, involved in the fatty acid biosynthesis pathway, and cheY and flaA, involved in flagellar mobility and assembly, were respectively over and under expressed in the presence of UFA or SFA. The differential expression of fabK could be linked to the regulation of the UFA versus SFA biosynthetic pathway. The presence of very long and numerous flagella in the presence of UFA at low temperatures was observed by transmission electron microscopy. This remarkable phenotype could be involved in the ability of L. monocytogenes to form biofilms and persist in production environments.