Un test en gouttes pour la sélection d'anticorps à partir de banques de levures

An in-droplet assay for the selection of antibodies from yeast libraries

• Auteur / Autrice : Estéban Lebrun
• Direction : Jean-Marc Nicaud, Guillaume Mottet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Soutenance le 15/03/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : AgroParisTech (France ; 2007-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
• Jury : Président / Présidente : Patrick Fickers
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fayza Daboussi, Grégory Batt, Virginie Courtois, Juliette Martin, Philippe Nghe
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrick Fickers, Fayza Daboussi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microfluidique

Biotechnologie

Yarrowia lipolytica

Innovation

Méthodologie

Identification

Anticorps

Mots clés libres

Microfluidique en gouttes

Anticorps

Levure

Criblage

Banque

Biologie synthétique

Droplet microfluidics

Antibody

Yeast

Screening

Library

Synthetic biology

Résumé

L'identification de nouveaux anticorps est un champ majeur de la recherche pharmaceutique qui souffre encore d'un processus de découverte long et coûteux incluant plusieurs étapes successives de criblage de banques. Ces criblages sont soumis à plusieurs contraintes qui imposent de travailler dans un premier temps avec des formes tronquées des anticorps qui doivent être reformatées par la suite. L'objectif de cette thèse est de développer une plateforme de criblage surpassant les méthodes actuelles et permettant l'identification et le tri à haut débit d'anticorps entiers et sécrétés. Pour cela, nous avons optimisé la levure Yarrowia lipolytica pour la sécrétion d'anticorps et développé une cassette d'expression utilisant un promoteur bidirectionnel inductible pour co-exprimer les gènes codant pour les deux chaînes des anticorps. Cette cassette d'expression a été construite par un assemblage Golden Gate dédié qui nous a permis de comparer 169 combinaisons de peptides signaux pour la sécrétion des anticorps. En utilisant la microfluidique en gouttes, nous avons ensuite mis au point un essai de reconnaissance d'antigène à l'échelle de la cellule unique pour identifier et sélectionner les levures sécrétant des anticorps d'intérêt. Nous avons démontré qu'il était possible de récupérer les levures triées pour continuer la caractérisation des anticorps spécifiques sans étape additionnelle de reformatage. Ainsi, en regroupant les technologies d'ingénierie des levures et de microfluidique en gouttes, nous avons développé un processus capable d'isoler en quelques jours des anticorps spécifiques d'une cible parmi une banque synthétique de plusieurs millions de candidats. Ce processus a le potentiel de diviser drastiquement le temps nécessaire à la découverte de nouveaux anticorps thérapeutiques et de diagnostic.

The identification of new antibodies is a major field of pharmaceutical research that still suffers from a lengthy and costly discovery process that includes several successive steps of library screening. These screenings are subject to several constraints which impose to work initially with truncated forms of antibodies that must be reformatted afterward. This thesis aims to develop a screening platform that surpasses current methods and allows the identification and high-throughput sorting of secreted full-length antibodies. To this end, we optimized the yeast Yarrowia lipolytica for antibody secretion and developed an antibody expression cassette using an inducible bidirectional promoter to co-express the antibody heavy and light chain genes. This expression cassette was constructed by a dedicated Golden Gate assembly that allowed us to compare 169 combinations of signal peptides for antibody secretion. We then developed a single-cell bioassay using droplet microfluidics to identify and select yeasts that secrete antibodies of interest. We demonstrated that we could recover sorted yeasts for further antibody characterization without an additional reformatting step. Thus, by combining yeast engineering and droplet microfluidic technologies, we have developed a process capable of isolating target-specific antibodies from a synthetic library of millions of candidates within days. This process has the potential to drastically reduce the time required to discover new antibodies for therapeutic and diagnostic applications.