Une approche de criblage et d'apprentissage pour la sécrétion de protéine chez la levure.

A screening and learning approach for protein secretion in yeast.

• Auteur / Autrice : Alicia Da Silva
• Direction : Grégory Batt, Senta Heiss-blanquet
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Experimental and Computational Methods for Modeling Cellular Processes
• Partenaire(s) de recherche : Référent : AgroParisTech

Mots clés

Mots clés libres

Biologie de synthèse

Criblage

Apprentissage

Synthetic Biology

Screening

Learning

Résumé

Les enzymes issues de la biodiversité constituent un énorme réservoir pour améliorer les cocktails de dégradation de la biomasse végétale ou pour trouver des enzymes pour la biologie synthétique. L'analyse de leur activité et leur caractérisation nécessitent néanmoins une expression dans des organismes hôte capables de les produire en quantité suffisante. Pour l'expression des enzymes eucaryotes, des levures comme Pichia pastoris ou Saccharomyces cerevisiae sont très souvent utilisées compte tenu de leur croissance rapide, la facilité de transformation et leur bonne capacité de sécrétion. Or, le succès de l'expression hétérologue dans ces organismes est aléatoire en fonction de la protéine à produire, et une stratégie employée pour optimiser la production d'une protéine peut ne pas s'appliquer à une autre. Il est donc nécessaire de mieux appréhender les paramètres influant sur la sécrétion et de disposer d'un moyen de produire des protéines variées d'une façon robuste. C'est pourquoi, dans la présente thèse, nous proposons de développer un outil de prédiction pour une sécrétion optimale. Dans un premier temps, l'impact des paramètres tels que l'utilisation préférentielle de codons, la nature du peptide signal et les facteurs impliqués dans le système de sécrétion sera évalué. Nous utiliserons comme cas d'étude 3 types d'enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse : des cellobiohydrolases de famille GH6, des xyloglucanase de famille GH74 et les LPMO. Des banques de 105 variants possédant des fonds génétiques différents, incluant l'invalidation ou la surexpression de 500 gènes cibles codant pour des facteurs de la voie de sécrétion, 10 peptides signaux et 20 encodage de la protéine à produire, seront construites pour différents représentants de chaque famille d'enzyme. Les banques seront criblées par la méthode « auto-growth » basée sur le couplage entre la sécrétabilité d'une protéine et la croissance de la souche. La population sera enrichie en souches possédant les meilleures capacités de sécrétabilité. Leur identification sera réalisée par séquençage profond de la bibliothèque complète à différents moments de la culture. Dans une seconde étape, une approche de machine learning sera utilisée dans le but de développer des modèles prédictifs des impacts des conditions de sécrétion pour une protéine donnée. Enfin, les enzymes seront produites dans des conditions optimales et sous-optimales pour vérifier le pouvoir prédictif du modèle, puis leur activité testée.

Enzymes derived from biodiversity represent an enormous reservoir for improving plant biomass degradation cocktails or for finding enzymes for synthetic biology. However, analysing their activity and characterising them requires expression in host organisms capable of producing them in sufficient quantities. For the expression of eukaryotic enzymes, yeasts such as Pichia pastoris or Saccharomyces cerevisiae are very often used, given their rapid growth, ease of transformation and good secretion capacity. However, the success of heterologous expression in these organisms is random depending on the protein to be produced, and a strategy used to optimise the production of one protein may not apply to another. There is therefore a need for a better understanding of the parameters influencing secretion and a means of producing a variety of proteins in a robust manner. In this thesis, we therefore propose to develop a prediction tool for optimal secretion. Initially, the impact of parameters such as the preferential use of codons, the nature of the signal peptide and the factors involved in the secretion system will be assessed. We will use 3 types of enzymes involved in biomass degradation as case studies: cellobiohydrolases of the GH6 family, xyloglucanases of the GH74 family and LPMOs. Libraries of 105 variants with different genetic backgrounds, including the invalidation or overexpression of 500 target genes encoding factors in the secretion pathway, 10 signal peptides and 20 encodings of the protein to be produced, will be constructed for different representatives of each enzyme family. The libraries will be screened using the 'auto-growth' method based on the coupling between the secretability of a protein and the growth of the strain. The population will be enriched in strains with the best secretability capacities. They will be identified by deep sequencing of the complete library at different times during the culture. In a second stage, a machine learning approach will be used to develop predictive models of the impact of secretion conditions for a given protein. Finally, enzymes will be produced under optimal and sub-optimal conditions to verify the predictive power of the model, and their activity tested.