Conception d'un système quasi-autocrine pour le criblage de bibliothèques pour la bioproduction de proteines chez S. cerevisiae

Engineering an autocrine-like system for screening libraries of protein secreting strains in yeast

• Auteur / Autrice : Henri Galez
• Direction : Grégory Batt
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Inscription en doctorat le 12/09/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Experimental and Computational Methods for Modeling Cellular Processes
• Partenaire(s) de recherche : Référent : AgroParisTech

Mots clés

Mots clés libres

Bioproduction

Yeast

Biologie de syntèse

Bioproduction

Yeast

Synthetic biology

Résumé

Les protéines recombinantes sont présentes dans de nombreux aspects de notre vie, des lipases dans les détergents aux anticorps monoclonaux dans les immunothérapies. Les prédictions concernant le marché de l'expression des protéines indiquent une expansion dans les années à venir. La levure est un organisme largement utilisé pour l'expression des protéines recombinantes, grâce à la sécrétion de la protéine dans le milieu de culture ce qui simplifie les étapes de purification ultérieures. L'expression d'une protéine d'intérêt dans un organisme non-natif nécessite une optimisation. Dans le cas de l'expression à partir de la levure, cette optimisation peut se faire par l'ingénierie de l'organisme hôte, du gène codant pour la protéine, du promoteur et du peptide signal. Ces paramètres définissent le contexte de sécrétion d'une souche. Actuellement, l'optimisation du contexte de sécrétion se fait à faible débit et se heurte à des goulots d'étranglement spécifiques à chaque protéine, ce qui rend le processus non trivial et chronophage. Le projet vise à explorer une grande diversité de contextes génétiques pour la sécrétion de protéines chez la levure et à identifier les meilleurs. Le défi central consiste à mettre au point un système de communication ''quasi-autocrine'' tel que les souches secrétant le plus de protéines se multiplient plus rapidement. Le système de communication tirera profit de la technologie « yeast-display » pour imiter la sécrétion, car une protéine ancrée emprunte la voie de sécrétion tout comme une protéine sécrétée. Les protéines exposées à la surface de la cellule activeront une voie de signalisation menant à l'expression d'un gène rapporteur permettant la détection des cellules exposant le plus de protéines. Ensuite nous construirons une grande bibliothèque de souches différant par leurs capacités de sécrétion en variant les paramètres mentionnés ci-dessus de façon combinatoire. L'enrichissement relatif des différentes souches dans la population globale sera mesuré par séquençage profond et nous permettra d'identifier les souches les plus productives. La technologie développée au cours de ce projet permettrait de débloquer une étape limitante pour la production de protéines recombinantes chez la levure. De plus, le « yeast-display » est un domaine à part entière avec de nombreuses applications comme le développement de biocatalyseurs, la bio-remédiation, les biocapteurs ou la production de bioéthanol. Les contextes génétiques identifiés avec notre technologie permettraient d'améliorer l'exposition de la protéine, ce dont bénéficierait les applications mentionnées précédemment.

Recombinant proteins are present in many aspects of our lives, from lipases in laundry detergent to monoclonal antibody in immunotherapies. The protein expression market is predicted to expand in the coming years. Yeast is a widely used organism for recombinant protein expression, through the secretion of the protein in the growth medium which facilitates the downstream purification process. Expressing a protein of interest in its non-native organism requires optimization. In the case of expression from yeast, such optimization can be done by engineering the host organism, the gene encoding the protein, the promoter and the peptide-signal. These parameters define the secretion background of a strain. Currently, optimization of the secretion background is made with low-throughput and faces protein-specific bottlenecks making the task non-trivial and time consuming. The project aims to explore a broad diversity of protein secretion backgrounds in yeast and identify the best ones in a high through-put manner. The central challenge is to engineer an autocrine-like communication system by which strains secreting more proteins grow faster. The communication system will leverage the well characterized yeast-display technology as proxy for secretion, since both anchored and secreted proteins take the secretory pathway. Proteins displayed at the cell surface will activate a signaling pathway leading to the expression of a reporter gene allowing the detection of cell displaying the most. Then we will construct a large library of yeast strains with different secretion backgrounds by varying parameters mentioned above in combinatorial manner. The relative enrichment of the various strains in the population will be measured by deep sequencing and will allow us to identify the best producing strains. The technologies developed during this project would allow to unlock a limiting step for the production of recombinant proteins in yeast. Moreover, yeast-display is a field on its own for the development of whole cell biocatalyst, bioremediation, bio-sensor or bioethanol production. The background identified with our technology could be used to improve display in many applications.