Stratégie thérapeutique par saut d'exon utilisant des oligonucléotides antisens ADN-tricycliques palmitoylés pour l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive

Therapeutic strategy of exon skipping using palmitoylated tricyclo-DNA antisense oligonucleotides for recessive dystrophic epidermolysis bullosa

• Auteur / Autrice : Guillaume Mondon
• Direction : Alain Hovnanian, Matthias Titeux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 13/12/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Martine Bagot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Aurélie Goyenvalle
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christina Has, Denis Furling

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exons

Oligonucléotides

Épidermolyses bulleuses dystrophiques

Mots clés libres

Epidermolyse

Bulleuse

Dystrophique

Récessive

Saut

Exon

ADN

Tricyclique

Acide

Palmitique

Recessive

Dystrophic

Epidermolysis

Bullosa

Exon

Skipping

DNA

Tricyclo

Palmitic

Acid

Résumé

L'Épidermolyse Bulleuse Dystrophique (EBD) est un groupe de maladies génétiques rares de la peau, héritée de manière dominante (EBDD) ou récessive (EBDR), et caractérisée par la formation de décollements bulleux de la peau et des muqueuses après des traumatismes légers. La maladie entraîne des complications locales et systémiques graves, y compris la fusion des doigts et des orteils, des sténoses oesophagiennes, des décollements cornéens, et le développement de carcinomes épidermoïdes cutanés agressifs, représentant la principale cause de décès chez ces patients. L'EBD est causée par des variants pathogènes entraînant une perte de fonction du gène COL7A1, codant le collagène de type VII (C7), qui est le composant majeur des fibres d'ancrage, structures essentielles à l'adhésion dermo-épidermique. Plus de 1200 variants pathogènes ont été identifiés dans COL7A1, composé de 118 petits exons. Parmi ceux-ci, 82 exons consécutifs codant le domaine collagène central sont en phase, dont l'excision n'affecte potentiellement pas la fonction de la protéine, faisant de COL7A1 une cible prometteuse pour le saut d'exon médié par les oligonucléotides antisens (ASO). J'ai d'abord développé une séquence antisens composée d'ADN tricyclique conjugué à un acide palmitique (Palm Tc-ADN), ciblant l'exon 73 fréquemment muté. La transfection de cet ASO dans les kératinocytes et fibroblastes primaires de patient atteint d'EBDR induit un saut efficace de l'exon 73 et une réexpression de C7, démontrée par des analyses de western blot et d'immunofluorescence. Les études préliminaires de toxicologie in vitro ont montré que l'ASO ne forme pas d'homodimères ni n'induit d'activation du complément. Pour démontrer la faisabilité de cette approche sur les transcrits humains de COL7A1 in vivo, j'ai d'abord injecté cet ASO par voie sous-cutanée ou intraveineuse dans un modèle murin transgénique (mCol7a1-/-;TghCOL7A1) portant l'intégralité du locus génomique humain de COL7A1. L'analyse des transcrits issus des tissus affectés dans l'EBDR (peau, oeil et oesophage) a révélé des niveaux variables de saut de l'exon 73 in vivo, en cohérence avec les résultats de biodistribution de l'ASO. J'ai ensuite voulu démontrer la réexpression de C7 dans un modèle de peau humaine reconstruite à partir de kératinocytes et de fibroblastes issus d'un patient EBDR portant un variant perte de fonction dans l'exon 73, greffée sur un modèle murin immunodéficient (NMRI-Foxn1nu/nu). J'ai pu démontrer jusqu'à 30% d'expression de C7 et la formation de fibres d'ancrage à la jonction dermo-épidermique après deux injections sous-cutanées de 500 µg ou 1 mg d'ASO sous la peau reconstruite, ou après 4 ou 8 injections intraveineuses hebdomadaires à 50 mg/kg. Aucune réaction indésirable n'a été observée chez les souris traitées, et les analyses histopathologiques du foie, de la rate et des reins n'ont révélé aucune toxicité aiguë. J'ai ensuite étendu cette stratégie à trois autres exons de COL7A1 porteurs de variants récessifs fréquents et développé des ASO Palm Tc-ADN utilisés seuls ou en combinaison pour induire le saut de ces exons in vitro. Dans leur ensemble, ces données indiquent pour la première fois que l'administration systémique d'un ASO tricyclo-ADN palmitoylé restaure l'expression de C7 dans la peau en sautant l'exon 73 du pré-ARNm de COL7A1, et que cette approche pourrait être étendue à d'autres exons pour augmenter la population de patients EBDR éligibles à cette stratégie thérapeutique.

Dystrophic Epidermolysis Bullosa (DEB) is a group of orphan genetic skin disorders inherited in a dominant (DDEB) or recessive (RDEB) manner and characterised by severe skin and mucosae blistering after mild traumas. Severe forms leads to a wide range of local and systemic complications, including fusion of the digits and toes, esophageal strictures, corneal blisters and the development of aggressive squamous cell carcinomas which is the major cause of demise in these patients. DEB is caused by loss-of-function variants in COL7A1 encoding type VII collagen (C7), the major component of anchoring fibrils which are essential structures for dermal-epidermal adhesion. More than 1200 pathogenic variants have been identified in COL7A1, which contains 118 small exons. Of these, 82 consecutive exons are in frame and encodes the central collagenous domain which can potentially be shortened without affecting the protein function, making it an promising target for antisense oligonucleotide (ASO)-mediated exon skipping. I have first developed a palmitate-conjugated tricyclo-DNA ASO (Palm Tc-ADN) targeting the frequently mutated exon 73. Transfection of this ASO in primary keratinocytes and fibroblasts from RDEB patient induces efficient exon 73 skipping and re-expression of C7 as demonstrated by western blot and immunofluorescence analyses. In vitro preliminary toxicology studies showed that the ASO do not form homodimers nor activate complement. To demonstrate the feasibility of the approach on human COL7A1 transcripts in vivo, I first injected subcutaneously or intravenously this ASO in a transgenic murine model (mCol7a1-/-;TghCOL7A1) carrying the entire human COL7A1 genomic locus. Analysis of transcripts from tissues affected in RDEB (skin, eye, and oesophagus) revealed variable levels of exon 73 skipping in vivo, consistent with the results of ASO biodistribution. I then aimed to demonstrate C7 re-expression in a model of reconstructed human skin made of keratinocytes and fibroblasts isolated from an RDEB patient carrying a null mutation in exon 73 grafted onto an immunodeficient murine model (NMRI-Foxn1nu/nu). I was able to demonstrate up to 30% of C7 expression and formation of anchoring fibrils at the dermal-epidermal junction following either two subcutaneous injections of 500 µg or 1 mg of the ASO under the graft, or after 4 or 8 weekly intravenous injections at 50mg/kg. No adverse reactions were observed in the treated mice, and histopathology analyses of liver, spleen and kidneys failed to demonstrate acute toxicity. I have then expanded this strategy to three other exons of COL7A1 carrying frequent recessive mutations and developed Palm Tc-DNA ASOs that were used alone or in combination to induce in-frame skipping of these exons in vitro. Overall, these data indicate for the first time that systemic administration of palmitoylated tricyclo-DNA ASO restores C7 expression in the skin by skipping exon 73 of COL7A1 pre-mRNA and that this approach could be expanded to other exons to increase the population of RDEB patients amenable to this therapeutic strategy.