L'hétérochromatine comme marqueur de l'état de pluripotence : comparaison de modèles in vivo (embryons de mammifères) et in vitro (cellules souches)

Heterochromatin as a pluripotency marker : comparison between in vivo (mammals embryos) and in vitro (stem cells) models

• Auteur / Autrice : Mélanie Pailles
• Direction : Amélie Bonnet-Garnier, Alice Jouneau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie de la reproduction
• Date : Soutenance le 04/07/2022
• Etablissement(s) : Paris, AgroParisTech
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie de la reproduction, environnement, épigénétique, et développement (Jouy-en-Josas,Yvelines ; 1995-....) - AgroParisTech (France ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Sébastien Bloyer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amélie Bonnet-Garnier, Michel Cohen-Tannoudji, Jérôme Déjardin, Véronique Azuara, Clémence Kress
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Michel Cohen-Tannoudji, Jérôme Déjardin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Embryons

Mammifères

Cellules souches

Hétérochromatine

Mots clés libres

Hétérochromatine

Embryon

Cellules souches

Pluripotence

Heterochromatin

Embryo

Stem cells

Pluripotency

Résumé

A la suite de la fécondation, le génome embryonnaire subit différents remodelages épigénétiques et structuraux, nécessaires à son activation. Ces différents remaniements se poursuivent tout au long du développement, alors que l’embryon progresse de l’état de totipotence vers la pluripotence et la différentiation. La pluripotence est un état complexe et transitoire au cours duquel les cellules à l’origine du futur organisme progressent d’un état « naïf » vers un état « amorcé ». L'émergence et l'évolution de la pluripotence s'accompagnent notamment de changements dans la distribution de la méthylation de l'ADN et des modifications post-traductionnelles des histones. De précédents travaux avaient mis en évidence que le profil épigénétique de l’hétérochromatine péricentromérique permet de discriminer les cellules murines pluripotentes naïves et amorcées in vitro. Notamment, H3K27me3 est retrouvée aux chromocentres des mESCs naïves tandis qu'elle est absente des chromocentres des mEpiSCs amorcées. Ainsi, ce projet avait pour objectifs de (i) décrire le profil épigénétique des chromocentres au cours du développement précoce murin, (ii) identifier les acteurs qui participent à l’apposition de H3K27me3 aux chromocentres, et (iii) déterminer si ces mêmes caractéristiques épigénétiques sont conservées aux chromocentres du blastocyste bovin et/ou dans les ESCs bovines.Nous avons montré que, dans l’embryon murin, H3K27me3 s’accumule aux chromocentres dès leur formation au stade 2-cellules et y est maintenue au cours du développement pré-implantation. De façon intéressante, la distribution de H3K27me3 semble être liée à la maturation du lignage pluripotent puisque le profil de H3K27me3 change au moment de la ségrégation de l’épiblaste naïf par rapport à l'endoderme primitif. Dans l’embryon post-implantation, H3K27me3 n'est plus présente aux chromocentres quel que soit le lignage, y compris l’épiblaste pluripotent amorcé. Nous avons pu souligner des différences entre la situation in vivo – où le profil de H3K27me3 est homogène dans l’ensemble des cellules de l’épiblaste – et ce qui avait été décrit in vitro dans les mESCs. Enfin, il a été mis en évidence que la présence de H3K27me3 aux chromocentres n’est pas impliquée dans le contrôle transcriptionnel des séquences péricentromériques puisque leur transcription tend à diminuer au cours du développement, indépendamment de la présence de H3K27me3.Cette étude s’est également intéressée aux protéines EZH2 et BEND3, pour déterminer leurs implications respectives dans l’apposition de H3K27me3. Nous avons montré qu'EZH2 se localise en périphérie des chromocentres dès leur formation, conjointement à l’enrichissement progressif en H3K27me3 ; alors que BEND3 ne semble interagir avec les chromocentres qu’à partir du stade 8-cellules – suggérant que BEND3 n’est pas l’élément principal de recrutement d’EZH2 aux chromocentres dans l’embryon –. Ainsi, dans l’embryon pré-implantation et dans les mESCs non mutantes, la présence de BEND3 aux chromocentres n’est pas couplée à la présence de H3K27me3 – contrairement aux observations faites pour EZH2 dont le changement de distribution dans l’embryon précède le changement de localisation de H3K27me3 aux chromocentres –. A l’aide d’une approche par siRNA ciblant les transcrits EZH2 ou les transcrits BEND3, il a été mis en évidence que ni la forte diminution de BEND3, ni celle d‘EZH2, n’impactent la localisation de H3K27me3 aux chromocentres ou la transcription des séquences péricentromériques.Enfin, cette étude montre que H3K27me3 se localise en périphérie des chromocentres du blastocyste bovin. Cependant le profil de H3K27me3 ne semble pas évoluer avec la progression de l’état de pluripotence, contrairement à ce qui a été décrit pour le modèle murin. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que la localisation de H3K27me3 au niveau des chromocentres semble être une caractéristique du développement embryonnaire précoce quel que soit l'espèce.

Following fertilization, the embryonic genome undergoes various epigenetic and structural remodelings, essential for its activation. These various changes proceed further throughout development, as the embryo progresses from totipotency to pluripotency and differentiation. Pluripotency is a complex and transient state in which the cells that will later give rise to the future organism progress from a ''naïve'' to a ''primed'' state. The rise and progression of pluripotency is accompanied by changes in the distribution of DNA methylation and post-translational histones modifications. Previous work highlighted that the epigenetic profile of pericentromeric heterochromatin discriminates naive from primed murine pluripotent cells in vitro. Notably, H3K27me3, is found at the chromocenters of naive mESCs while this epigenetic mark is absent from the chromocenters of primed mEpiSCs. Thus, the objectives of this project were to (i) describe the epigenetic profile of chromocenters during early murine development, (ii) identify which actors are implied in the apposition of H3K27me3 to chromocenters, and (iii) determine whether these same epigenetic features are preserved at chromocenters of bovine blastocysts and/or in bovine ESCs.We showed that, in mouse embryo, H3K27me3 accumulates at the chromocenters from their formation at the 2-cell stage and is then maintained during pre-implantation development. Interestingly, the distribution of H3K27me3 seems to be related to the maturation of the pluripotent lineage since the profile of H3K27me3 changes upon segregation of the naive epiblast from the primitive endoderm. In the post-implantation embryo, H3K27me3 is not anymore at chromocenters whatever the lineages including the primed pluripotent epiblast. We were able to highlight important differences between the embryos in vivo - where the profile of H3K27me3 is homogeneous in all epiblast cells - and what was described in vitro in mESCs. Finally, we showed that the presence of H3K27me3 at chromocenters is not involved in the transcriptional control of pericentromeric sequences since their transcription tends to decrease during development, independently of the presence of H3K27me3.This study also focused on EZH2 and BEND3 proteins to assess their involvement in H3K27me3 apposition. We found that EZH2 localizes to the periphery of the chromocenters from their clustering, in conjunction with the progressive enrichment of H3K27me3; whereas BEND3 appears to interact with chromocenters only from the 8-cell stage onwards - suggesting that BEND3 is not the main driver of EZH2 recruitment to chromocenters in the embryo -. Similarly, in the pre-implantation embryo and in mESCs, the location of BEND3 at chromocenters does not correlate with the presence of H3K27me3 - in contrast to EZH2 whose change in distribution in the embryo precedes the change in localization of H3K27me3 at chromocenters -. Using a siRNA approach targeting either EZH2 or BEND3 transcripts, we showed that neither the strong reduction of BEND3, nor that of EZH2 influences the localization of H3K27me3 at chromocenters or the transcription of pericentromeric sequences.Finally, this study highlights that H3K27me3 is found at the chromocenters periphery in bovine blastocyst, although the profile of H3K27me3 at chromocenters seems not to evolve with the progression of pluripotency. These results highlighted similarities between species, where the localization of H3K27me3 at the chromocenters appears to be a feature of early embryonic development.