Développement d'approche thérapeutique par édition génomique pour les pathologies liées à RyR1 : de l'étude in vitro à l'application in vivo

Development of therapeutic approaches by gene editing for RyR1 related pathologies : From in Vitro Studies to in Vivo Applications.

• Auteur / Autrice : Margaux Melka
• Direction : Isabelle Marty, John Rendu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 30/09/2025
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Grenoble Institut des Neurosciences - [GIN] Grenoble Institut des Neurosciences
• Jury : Président / Présidente : Walid Rachidi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Allard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Caroline Le Guiner, Emiliano Ricci

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapie génique

CRISPR-Cas9

Calcium

Maladies musculaires

Mots clés libres

Myopathies

Calcium

Crispr/cas9

Thérapie génique

RyR1

Myopathies

Calcium

Crispr/cas9

Gene therapy

RyR1

Résumé

Le récepteur à la Ryanodine de type 1 (RyR1) est un canal calcique essentiel à la contraction du muscle squelettique. Des mutations dans le gène RYR1 sont responsables de maladies rares appelées « myopathies liées à RYR1 », qui se traduisent par une faiblesse musculaire chez les individus atteints. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour ces pathologies. L’un des principaux obstacles au développement de thérapies géniques pour les myopathies liées à RYR1 réside dans le nombre élevé et la large répartition des mutations au sein du gène RYR1. De plus, la thérapie de remplacement génique n’est pas envisageable en raison de la taille importante de ce gène.Afin de surmonter ces difficultés, nous avons développé une approche thérapeutique polyvalente visant à restaurer la fonction de RyR1, indépendamment de la mutation spécifique du patient. Notre stratégie repose sur la délétion ciblée de l’allèle pathogène à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Nous avons démontré l’efficacité de cette approche dans des myoblastes immortalisés dérivés d’un patient porteur d’une mutation dominante de RYR1. L’étape suivante consiste à appliquer cette méthodologie à un modèle murin.Pour cette preuve de concept in vivo, nous avons optimisé à la fois la méthode d’administration et l’efficacité des ARN guides (gRNAs). Dans un premier temps, nous avons étudié la meilleure voie d’administration permettant un haut niveau de transduction du tissu musculaire, avec une spécificité optimale. Nous avons utilisé un vecteur AAV à tropisme musculaire élevé, appelé MyoAAV, exprimant GFP comme gène rapporteur. Ensuite, nous avons effectué un criblage in vitro de différentes paires de gRNAs ciblant l’allèle pathogène, et sélectionné les candidats les plus efficaces pour l’édition génique in vivo. Ce projet ouvre la voie à l’application d’une nouvelle stratégie d’édition génomique pour le traitement des myopathies liées à RYR1.

The Ryanodine Receptor Type 1 (RyR1) is an essential calcium channel for skeletal muscle contraction. Mutations in the RYR1 gene are responsible of rare diseases called ''RyR1-related myopathies,'' which lead to muscle weakness in affected individuals. Currently, no cure exists for these conditions. One of the main obstacles in developing gene therapy for RyR1-related myopathies is the extensive number and widespread distribution of mutations within the RYR1 gene. Additionally, gene replacement therapy is not feasible due to the large size of the RYR1 gene.To address these challenges, we have developed a versatile approach to restore RyR1 function regardless of the specific patient mutation. Our strategy involves the targeted deletion of the pathogenic allele using CRISPR-Cas9 technology. We have demonstrated the efficiency of this approach in immortalized myoblasts derived from a patient with a dominant RYR1 mutation. The next step is to apply this methodology to a mouse model.For the in vivo proof-of-concept, we optimized both the delivery method and the efficiency of the guide RNAs (gRNAs). First, we explored the best route of administration to achieve high levels of transgene delivery in muscle tissue with optimal specificity. We used an AAV vector with strong muscle tropism, known as MyoAAV, which expresses Green Fluorescent Protein as a reporter. Next, we performed in vitro screening of various pairs of gRNAs targeting the pathogenic allele and we selected the most effective candidates for in vivo gene editing. Our project will pave the way for applying a novel strategy of genome editing to treat RyR1-related myopathies.