Ordre et désordre dans les formes toroïdales de l'ADN condensé analysés par cryo-microscopie électronique

Order and disorder in condensed DNA toroids analysed by cryo-electron microscopy

• Auteur / Autrice : Kahina Vertchik
• Direction : Amélie Leforestier, Guillaume Brunetti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 09/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physique des solides (Orsay, Essonne)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté de pharmacie
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Entreprise : JEOL Europe SAS (Croissy Sur Seine, Yvelines)
• Jury : Président / Présidente : Martin Lenz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Denis Chretien, Rudolf Podgornik, Damien Alloyeau, Jean-Marc Victor
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Denis Chretien, Rudolf Podgornik

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électrostatique

Microscopie électronique en transmission

Cryomicroscopie

Condensation

Mots clés libres

Tores d'ADN

Condensation de l'ADN

Cryo-Microscopie électronique en transmission

Electrostatic zipper

DNA toroids

DNA condensation

Cryo Transmission Electron Microscopy

Electrostatic zipper

Résumé

Les tores d'ADN sont des structures cristallines liquides formées spontanément par la condensation de molécules d'ADN en solution par un agent de condensation tel que la spermine 4+. Ces tores servent de modèles pour comprendre le repliement des chromosomes dans certains virus à ADN double brin et pour leur potentiel en nano-ingénierie. La caractérisation détaillée de leur organisation tridimensionnelle reste limitée à un ordre hexagonal localisé. Cette thèse vise à élucider la structure fine et le mécanisme de formation des tores d'ADN, encore mal compris malgré de nombreuses études théoriques et simulations. Au Laboratoire de Physique des Solides (LPS), nous avons développé un protocole permettant de contrôler la courbure des tores sur une large gamme dimensionnelle, de quelques dizaines à plusieurs centaines de nanomètres. Ceci permet d'étudier la morphogenèse des tores par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-TEM), une technique désormais largement utilisée pour observer des structures biologiques dans leur état natif, après vitrification à basse température. Les images obtenues par cryo-TEM ont révélé un ordre hexagonal au sein des tores d'ADN, en accord avec les résultats connus. Nous avons identifié des corrélations entre les doubles hélices d'ADN, formant une ''fermeture éclair'' électrostatique. Notre étude révèle que l'optimisation des corrélations hélicoïdales est associée à des réarrangements ausein du tore au fur et à mesure de sa croissance, l'établissement de la corrélation étant suivi d'une mise en forme polygonale. En outre, une diminution locale du pas hélicoïdale de l'ADN est mesurée dans les régions à forte courbure. Nous démontrons une ségrégation ordre-désordre au sein des tores, avec des défauts structurels (extrémités de l'ADN et défauts de '' pont '') concentrés dans un secteur spécifique du tore. Ce phénomène joue un rôle dans l'optimisation des interactions électrostatiques, y compris la fermeture éclair électrostatique. Enfin, nous avons initié la microscopie électronique en phase liquide, une technique émergente pour étudier la dynamique des processus biologiques à l'échelle nanométrique. Notre objectif est de suivre la formation des tores, depuis leur nucléation jusqu'à leur état final. Nous avons obtenu des images préliminaires sur des bactériophages, utilisés ici comme précurseurs du tore. Cette approche innovante ouvrirait de nouvelles perspectives pour comprendre la morphogenèse des tores d'ADN et pourrait potentiellement révéler des mécanismes fondamentaux qui sous-tendent leur formation et leur stabilité. Cette étude des tores d'ADN combine des approches expérimentales pour explorer leur structure, leur dynamique et leur mécanisme de formation. Ces résultats contribuent à notre compréhension fondamentale de la biophysique des états condensés de l'ADN.

DNA toroids are liquid crystalline structures formed spontaneously by the condensation of DNA molecules in solution by a condensation agent such as spermine 4+. These toroids serve as models for understanding chromosome folding in certain double-stranded DNA viruses and for their potential in nano-engineering. Detailed characterisation of their three-dimensional organisation remains limited to a localised hexagonal order. This thesis aims to elucidate the fine structure and formation mechanism of DNA toroids, which are still poorly understood despite numerous theoretical studies and simulations.At the Solids Physics Laboratory (LPS), we have developed a protocol for controlling the curvature of toroids over a wide dimensional range, from a few tens to several hundreds of nanometres. This enables to study toroid morphogenesis by cryo Transmission Electron Microscopy (cryo-TEM), a now widely used technique for observing biological structures in their native state, after vitrification at low temperature.The images obtained by cryo-TEM revealed an hexagonal order within the DNA toroids, in agreement with previous results. We identified correlations between the DNA double helices, forming an electrostatic 'zipper'. Our study reveals that optimization of the helical correlations is associated with rearrangements within the toroid as it grows, with the establishment of correlation followed by polygonal shaping. In addition, a local decrease in the DNA helical repeat is measured in high curvature regions.We demonstrate an order-disorder segregation within toroids, with structural defects (DNA ends and “bridge” defects) concentrated in a specific sector of the toroid. This phenomenon plays a role in optimization of electrostatic interactions, including the electrostatic zipper.Lastly, we have initiated liquid phase electron microscopy, an emerging technique for studying the dynamics of biological processes at the nanoscale. We aim to follow toroid's formation, from their nucleation to their final state. We obtained preliminary images on bacteriophages, used here as a precursor of the toroid. This innovative approach would open up new perspectives for understanding the morphogenesis of DNA toroids and could potentially reveal fundamental mechanisms underlying their formation and stability.This study of DNA toroids combines experimental approaches to explore their structure, dynamics and formation mechanism. These results contribute to our fundamental understanding of the biophysics of condensed states of DNA.