Contribution à l'optimisation de la culture de Clostridium tetani pour la production de toxine tétanique en milieu chimiquement défini

Contribution to Clostridium tetani cultivation optimization for toxin production in chemically defined medium

• Auteur / Autrice : Lucile Garrigues
• Direction : Stéphane Guillouet, Isabelle Meynial
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 04/05/2021
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering
• Jury : Président / Présidente : Michel-Robert Popoff
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Chevalot, Mickaël Desvaux, Gilles PRéVOST, Dominique Garnier, Stéphane Guillouet, Isabelle Meynial-salles
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Chevalot, Mickaël Desvaux, Gilles PRéVOST

Mots clés

Mots clés libres

Clostridium tetani

Production toxine tétanique

Fermentation

Milieu chimiquement défini

Schéma métabolique

Clostridium tetani

Tetanus toxin production

Fermentation

Chemically defined medium

Metabolic map

Résumé

Clostridium tetani est industriellement cultivé depuis des décennies pour produire la toxine tétanique, utilisée pour la fabrication du vaccin immunisant contre le tétanos. Le milieu de culture actuellement utilisé en industrie est un milieu complexe décrit dans les années 1960. Cependant, à cause d’une variabilité induite par l’utilisation de matières premières complexes et pour éviter d’éventuelles réactions allergiques liées à la présence de composés d’origine animale, l’Organisation Mondiale de la Santé encourage les producteurs de vaccins à cultiver C. tetani en milieu chimiquement défini. Malgré quelques tentatives décrites dans la littérature, aucun milieu défini n’a permis de produire de la toxine tétanique. Une première preuve de concept pour la synthèse de toxine sur milieu défini a été obtenue par les équipes de Sanofi Pasteur. L’objectif de ce travail est de contribuer à l’optimisation de la production de toxine par C. tetani, en développant un milieu chimiquement défini combiné à une stratégie de fermentation adaptée. La comparaison entre une culture en milieu complexe et une culture en milieu défini a montré que la toxine était principalement synthétisée lors de la phase linéaire de croissance, qui dure 9 heures en milieu défini contre 70 heures en milieu complexe, expliquant la faible quantité de toxine obtenu en milieu défini. Des cultures continues et fed-batchs, jamais décrites pour la culture de C. tetani en milieu chimiquement défini, ont permis d’identifier les acides aminés essentiels à la croissance – glutamate, histidine, tyrosine et cystine – et de quantifier les besoins nutritionnels de chaque acide aminé. La source principale de carbone est le glutamate, le glucose n’étant que partiellement assimilé par C. tetani dans les conditions testées. Les différentes cultures en milieu défini ont permis d’élucider la stoechiométrie de la voie de dégradation du glutamate, avec deux moles de glutamate donnant deux moles d’acétate et une mole de butyrate. Le glucose semble être uniquement dégradé en acétate. Le glutamate étant le substrat carboné principal en milieu défini, la synthèse d’acides organiques est majoritaire face à la production de biomasse. Nous avons également montré que C. tetani est une bactérie anaérobie stricte, contrairement à ce qui était admis dans la littérature. L’analyse des acides aminés a permis d’identifier la méthionine et l’aspartate comme étant des acides aminés clés pour la synthèse de toxine. En culture continue, la consommation de ces acides aminés mais aussi la synthèse de toxine sont inhibées par des taux de dilution supérieur à 0.06 h-1 et une vitesse de consommation du glutamate supérieure à 1.0 g/gX.h. Ainsi, la production de toxine atteint un maximum de 15 Lf/mL en culture continue à de faibles taux de dilution (0.03 h-1, 0.06 h-1), imposant une vitesse de consommation du glutamate inférieure à 1.0 g/gX.h et une limitation en méthionine et aspartate. Grâce à la caractérisation des besoins en acide aminés de C. tetani, et à l’identification des conditions augmentant la synthèse de toxine, un milieu d’alimentation chimiquement défini et des stratégies fed-batch pourront être développées pour maintenir une phase linéaire de croissance chez C. tetani et atteindre une production de toxine finale similaire au titre obtenu en milieu complexe.

Clostridium tetani is industrially grown for decades to produce tetanus toxin, used for the manufacturing of the tetanus vaccine. The culture medium currently used in industry is a complex medium described in the 1960s. However, because of a variability induced by the use of complex raw material and to avoid eventual allergic reactions related to the presence of animal-source compounds, the WHO encourages the manufacturers to cultivate C. tetani in chemically defined medium. Despite few attempts described in the literature, no defined medium achieved to produce tetanus toxin. A first proof of concept for toxin synthesis in defined medium was obtained by Sanofi Pasteur’s teams. The objective of this work is to contribute to the optimization of the tetanus toxin production by C. tetani, by designing a chemically defined medium but also an adapted strategy of fermentation. The comparison between a culture in complex medium and a culture in defined medium showed that the toxin was mainly synthesized during the linear growth phase, which lasts 9 hours in defined medium against 70 hours in complex medium, explaining the poor toxin amount obtained in defined medium. Continuous and fed-batch cultures, never described in the literature, resulted in the identification of the amino acids essential for growth – glutamate, histidine, tyrosine and cystine – and the quantification of the nutritional requirements for each amino acid. The main carbon source is glutamate, glucose only being partially assimilated by C. tetani in the experimented conditions. The different cultures in defined medium clarified the stoichiometry of the glutamate degradation pathway, with two moles of glutamate giving two moles of acetate and one mole of butyrate. Glucose seems to be only degraded into acetate. As glutamate is the main carbon source in defined medium, the organic acid synthesis prevails over the biomass production. We also showed that C. tetani is an obligate anaerobe, contrary to what was suggested in the literature. The amino acid analysis identified methionine and aspartate as key amino acids for toxin synthesis. In continuous culture, these amino acid consumptions but also the toxin synthesis are inhibited for dilution rates over 0.06 h-1 and a glutamate consumption rate over 1.0 g/gX.h. Thus, the toxin production reach a maximum of 15 Lf/mL in continuous culture at low dilution rates (0.03 h-1, 0.06 h-1), leading to a glutamate consumption rate under 1.0 g/gX.h and methionine and aspartate limitations. Through the characterization of C. tetani amino acid requirements and the identification of the conditions promoting toxin synthesis, a chemically defined feeding medium and fed-batch strategies could be developed to maintain a linear growth phase during C. tetani culture, and reach a final toxin production similar to the titer obtained in complex medium.