Analyse du métabolisme et modélisation des flux dans des tiges de tomate infectées par Botrytis cinerea sous différentes disponibilités en azote

by Nathalie Lacrampe

Doctoral thesis in Sciences Agronomiques

Under the supervision of Raphaël Lugan.

defended on 19-05-2022

in Avignon , under the authority of École doctorale 536 « Sciences et agrosciences » (Avignon) , in a partnership with Qualisud (Montpellier) (laboratoire) .

Thesis committee President: Marc Bardin.

Thesis committee members: Pierre Pétriacq, Nadia Bertin, Sophie Colombié, François Lecompte.

Examiners: Marie-Christine Soulié, Alain Bouchereau.

  • Alternative Title

    Metabolic analysis and fluxes modelling of Botrytis cinerea-infected tomato stems under different nitrogen availability


  • Abstract

    The plants nitrogen nutrition influences the intensity of epidemics caused by pathogenic fungi through multiple causes with underlying mechanisms that are still poorly understood. The nitrogen availability affects the metabolism of the host plant tissue and ensures the maintenance of cellular homeostasis, which is essential for their defence. The objective of this work was to compare the metabolism of stem tissues in healthy tomato plants and those infected with the necrotrophic fungus Botrytis cinerea, using nitrogen nutrition gradients leading to variable levels of fungal development, in order to identify metabolic processes favourable for resistance. Contrasted levels of susceptibility to B. cinerea were obtained by growing tomato plants at five nitrogen nutrition levels, ranging from a severe deficit (0.5 mM NO3-) leading to high susceptibility, to an excess (20 mM NO3-) leading to high resistance. Symptomless stem samples, free of fungal tissues, were harvested near the lesions, or in equivalent areas on mock-inoculated plants, before, and 2, 4, and 7 days after inoculation.A gene transcription analysis, targeted on the metabolism of main soluble sugars (sucrose, glucose, fructose), showed a differential expression of genes encoding for invertases, sucrose synthases, hexokinases, fructokinases and phosphofructokinases. Compared to mock-inoculated plants, plants infected with B. cinerea presented at low nitrogen levels a repression of the majority of genes, while they were over-expressed at high nitrogen nutrition. An early over-expression of a sucrose synthase and a phosphofructokinase gene, which seems to be specifically induced by the infection, was observed in the most resistant plants. Quantitative and semi-quantitative profiling of primary and secondary metabolites indicated, in highly susceptible plants, significant contrasts between 0.5 mM and 5 mM NO3‒ supply, with major changes in metabolism, whereas less susceptible plants, under high nitrogen nutrition, showed only few infection-related molecules. A growth analysis of the studied stem portions showed a mass growth of infected plants, compared to healthy ones, all the stronger that nitrogen was limiting. However, this growth was accompanied by a decrease (under 2 and 5 mM NO3‑) or an absence (under 0.5 mM NO3‒) of protein accumulation that appears to be necessary for defence. A flux balance analysis (FBA) model of metabolic fluxes was developed and then constrained with growth data and quantitative metabolomics analyses. The calculated fluxes were higher within the central metabolism of infected plants, with a particular increased activity of nitrogen metabolism, glycolysis and pentose-phosphate pathway, when fluxes are calculated per unit of imported carbon. Finally, hormonal profiles established on the samples showed variations of concentrations of hormones associated to stress responses as well as growth. In particular, following inoculation, an early decrease in abscisic acid (ABA) concentration was associated with susceptibility.In conclusion, this work illustrates the importance of metabolic adaptations and their determinants (gene expressions, hormonal signalling) in the response of sink tissues such as stems, following infection by a necrotrophic fungus. It points out the interest of combined and integrated genes expression, metabolomics and fluxomics approaches for the analysis of plant-pathogen interactions.


  • Abstract

    Analyse du métabolisme modélisation des flux dans des tiges de tomate infectées par Botrytis cinerea sous différentes disponibilités en azoteLa nutrition azotée des plantes influence l’intensité des épidémies causées par les champignons pathogènes au travers de phénomènes multiples aux mécanismes encore mal connus. La disponibilité en azote conditionne le métabolisme des tissus de la plante hôte et permet d’assurer le maintien de l’homéostasie cellulaire indispensable à leurs défenses. L’objectif de ce travail était de comparer le métabolisme de tissus de tiges de plantes de tomate saines et infectées par le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea, en utilisant des gradients de nutrition azotée aboutissant à des niveaux variables de développement fongique, afin d’identifier les processus métaboliques favorables à la résistance. Des niveaux contrastés de sensibilité à B. cinerea ont été obtenus en cultivant les plantes de tomate à cinq niveaux de nutrition azotée, allant d’un déficit sévère (0.5 mM NO3-) conduisant à une forte sensibilité, à un excès (20 mM NO3-) entrainant une forte résistance. Des échantillons de tige asymptomatiques, exemptes de tissus fongiques, ont été récoltés en bordure des lésions, ou dans des zones équivalentes chez des plantes non inoculées, avant, et 2, 4 et 7 jours après l’inoculation.Une analyse de transcription de gènes, ciblée sur le métabolisme des principaux sucres solubles (saccharose, glucose, fructose), a permis de montrer une expression différenciée des gènes codant pour les invertases, saccharose synthases, hexokinases, fructokinases et phosphofructokinases. En comparaison des plantes mock-inoculées, les plantes infectées par B. cinerea ont présenté à bas niveaux d’azote une répression de la majorité des gènes, tandis qu’ils ont été surexprimés à forte nutrition azotée. Un surcroit d’expression précoce d’un gène de saccharose synthase et de phosphofructokinase, qui semblent être spécifiquement induit par l’infection, a été observé chez les plantes les plus résistantes. Un profilage quantitatif et semi-quantitatif des métabolites primaires et secondaires a indiqué, chez les plantes très sensibles, des contrastes importants entre 0.5 mM et 5 mM d’apport de NO3‒ avec une évolution profonde du métabolisme, alors que les plantes moins sensibles, à forte nutrition azotée, ont présenté peu de molécules marqueurs de l’infection. Une analyse de la croissance des portions de tiges étudiées a montré une croissance en masse chez les plantes infectées, par rapport aux plantes saines, d’autant plus forte que l’azote était limitant. Cette croissance s’est cependant accompagnée d’une baisse (à 2 et 5 mM de NO3‒) ou d’une absence (à 0.5 mM de NO3‒) de l’accumulation de protéines qui semblent être nécessaires à la défense. Un modèle de flux métaboliques, de type flux balance analysis (FBA), a été développé puis contraint avec les données de croissance et les analyses métabolomiques quantitatives. Les flux calculés sont supérieurs au sein du métabolisme central chez les plantes infectées, avec en particulier une activité accrue du métabolisme azoté, de la glycolyse et de la voie des pentoses-phosphates, à carbone importé équivalent. Enfin, des profils hormonaux établis sur les échantillons ont montré des variations de concentrations des hormones associés à la réponse aux stress comme à la croissance. En particulier, suite à l’inoculation, une diminution précoce de la concentration en acide abscissique (ABA) est associée à la sensibilité.En conclusion, ce travail illustre l’importance de l’adaptation du métabolisme et de ses déterminants (expression génique, signalisation hormonale) dans la réponse de tissus puits tels que les tiges, suite à l’infection par un champignon nécrotrophe, et souligne l’intérêt des approches combinées et intégrées d’expression de gènes, de métabolomique et de fluxomique pour l’analyse de l’interaction plantes-pathogènes.


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