Exploration de sécrétomes d'Aspergillus spp. en vue de la complémentation du cocktail cellulolytique de Trichoderma reesei

Exploration of Aspergillus spp. secretomes for the complementation of Trichoderma reesei cellulolyticcocktail

• Auteur / Autrice : Camille Filiatrault chastel
• Direction : Antoine Margeot, Jean-Guy Berrin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Soutenance le 04/11/2019
• Etablissement(s) : Paris, Institut agronomique, vétérinaire et forestier de France
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut français du pétrole Énergies nouvelles (Rueil-Malmaison, Hauts-de-Seine)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Silar
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Silar, Isabelle Benoit, Claire Dumon, Gabriel Paës, Solange Morera, Senta Heiss-Blanquet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Benoit, Claire Dumon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Innovation

Complexes multienzymatiques

Aspergillus

Bioéthanol

Analyse

Tests

Lignocellulose

Recherche

Biomasse végétale

Mots clés libres

Bioéthanol

Biomasse lignocellulosique

Champignons filamenteux

Sécrétomes

Lpmo

Bioethanol

Lignocellulosic biomass

Filamentous fungi

Secretomes

LPMOs

Résumé

L’une des alternatives envisagées pour remplacer les ressources fossiles est l’utilisation de biomasse lignocellulosique. Cette ressource abondante et renouvelable, issue de la paroi des végétaux, est composée de polysaccharides et de polymères aromatiques liés entre eux qui lui confèrent une grande résistance. Aujourd’hui, la biomasse lignocellulosique est transformée en bioéthanol via un procédé dont l’une des étapes clé est la dégradation des polysaccharides en sucres fermentescibles. Pour cela, des enzymes, notamment des cellulases, hémicellulases et « lytic polysaccharide monooxygenases» (LPMO) sont utilisées. Ces enzymes sont sécrétées par des organismes dégradeurs de la biomasse tels que l’ascomycète Trichoderma reesei, un champignon filamenteux capable de sécréter de très grandes quantités de cellulases, mais qui possède une faible diversité enzymatique. L’hydrolyse enzymatique restant à ce jour une étape très coûteuse, il est nécessaire d’en améliorer encore les rendements. L’apport d’activités enzymatiques manquantes chez T. reesei à partir d’autres organismes fongiques est une approche prometteuse, qui a été développée dans le cadre de ce projet de thèse.Différentes souches du genre Aspergillus ont été étudiées afin d’y trouver des activités enzymatiques permettant d’améliorer l’hydrolyse de biomasses prétraitées. Pour cela, 5 souches ont été cultivées en présence de 3 inducteurs, et le contenu protéique de ces différents sécrétomes a été déterminé par spectrométrie de masse. Les sécrétomes ont ensuite été testés pour leur capacité à supplémenter un cocktail de T. reesei en améliorant ses rendements d’hydrolyse. L’analyse des protéines contenues dans quelques sécrétomes performants a révélé la présence d’une protéine appartenant à une famille putative de LPMO. Plusieurs protéines de cette famille ont été produites de manière recombinante et testées sur différents substrats en présence de partenaires redox. Une activité de clivage oxydatif de la cellulose a été démontrée, permettant la définition d’une nouvelle famille de LPMO fongiques, nommée AA16. Le prétraitement de substrats cellulosiques par les LPMO AA16 entraîne une amélioration significative de leur hydrolyse par une des cellulases de T. reesei, ce qui démontre l’intérêt potentiel de cette nouvelle famille d’enzymes pour des applications biotechnologiques dans le domaine des bioraffineries.

Lignocellulosic biomass is considered as a promising alternative to fossil resources. This abundant and renewable feedstock, derived from plant cell wall, is composed of polysaccharides and aromatic polymers linked together to form a highly resistant structure. Its transformation into bioethanol or other products requires the degradation of polysaccharides into fermentable sugars, using enzymes such as cellulases, hemicellulases and lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). These enzymes are secreted by biomass-degrading microorganisms, such as bacteria and filamentous fungi. The most commonly used is Trichoderma reesei, a fungal species that is known for its efficient secretion of cellulases, but has a low diversity of other enzymes. Enzymatic hydrolysis is still a bottleneck for the cost-effective utilization of lignocellulosic biomass, and needs to be optimized. Providing activities that are missing in T. reesei using enzymes produced by other fungal organisms is a promising approach, which has been implemented during this PhD project.Using a proteomic approach, different Aspergillus strains were studied in order to find enzymatic activities that could improve the hydrolysis of pretreated biomass. For this purpose, 5 strains were grown on 3 inducers, and the protein content of these different secretomes was determined by mass spectrometry. The secretomes were then tested for their ability to improve hydrolysis yields by supplementing a T. reesei cocktail. Analysis of the protein content of some of the best-performing secretomes revealed the presence of a protein belonging to a putative family of LPMO. Several proteins of this family were recombinantly produced and tested on different substrates in the presence of redox partners. Oxidative cleavage of cellulose was demonstrated, leading to the creation of a new LPMO family, called AA16. The pretreatment of cellulosic substrates by AA16 LPMOs resulted in a significant improvement of their hydrolysis by a cellulase from T. reesei, demonstrating their potential interest for biotechnological applications in biorefineries.