Approche moléculaire de la persistance de Listeria monocytogenes par la protéomique quantitative sans marquage (label-free)

Molecular insights into Listeria monocytogenes persistence via label-free quantitative proteomics

Μοριακές γνώσεις για την επιμονή του Listeria monocytogenes μέσω ποσοτικής πρωτεομικής χωρίς τη χρήση επισημάνσεων

• Auteur / Autrice : Lydia Palaiodimou
• Direction : Alessandro Pagliuso, Céline Henry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 17/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie de l'Alimentation au Service de la Santé humaine (Jouy-en-Josas)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté des sciences d’Orsay (Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Florence Dubois-Brissonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Rolhion, Olivier Dussurget, Luc Camoin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nathalie Rolhion, Olivier Dussurget
• DOI : 10.70675/1f55a4c6ze2a9z45a8z860az7e088a08e99d

Mots clés

Mots clés contrôlés

Listeria monocytogenes

Protéomique

Trophoblaste

Système immunitaire

Bactéries viables mais non cultivables

Marqueurs biologiques

Paroi cellulaire

Mots clés libres

Listeria monocytogenes

Protéomique

Trophoblastes

Système immunitaire

VBNC

Déficience de la paroi cellulaire

Listeria monocytogenes

Proteomics

Trophoblasts

Immune system

VBNC

Cell wall deficiency

Listeria monocytogenes

Πρωτεομική

Τροφοβλάστες

Ανοσοποιητικό σύστημα

VBNC

Έλλειψη κυτταρικού τοιχώματος

Résumé

Listeria monocytogenes (Lm) est un pathogène intracellulaire facultatif responsable de la listériose, une infection alimentaire particulièrement dangereuse pour les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées. Connue pour son adaptabilité, Lm persiste dans divers environnements, rendant son contrôle difficile. Lors d'infections prolongées de cellules épithéliales, telles que les hépatocytes et les trophoblastes, Lm passe d'un état réplicatif à un état quiescent au sein de vacuoles de type lysosomal, appelées Listeria-containing vacuoles (LisCVs). Cette transition est associée à la perte de ActA, protéine permettant la nucléation de l'actine, et à l'arrêt de la polymérisation de l'actine à la surface bactérienne. Au sein des LisCVs, la majorité des bactéries restent intactes et entrent dans un état peu voire non réplicatif jusqu'à atteindre un état viable mais non cultivable (VBNC), une forme dormante permettant la survie dans des conditions défavorables. L'infection prolongée des hépatocytes par Lm perturbe l'immunité de l'hôte, notamment en diminuant la sécrétion des protéines de phase aiguë (APP), essentielles à la réponse immunitaire. Ce processus pourrait empêcher l'élimination complète de Listeria du foie et favoriser ainsi l'établissement d'infection persistante. Lm montre également une capacité d'adaptation remarquable dans des environnements en dehors de l'hôte, notamment dans les milieux aquatiques, où il peut entrer dans un état VBNC. Les pathogènes VBNC posent un risque sanitaire majeur, car ils échappent aux méthodes de détection basées sur la croissance tout en conservant la capacité à se réactiver vers des formes virulentes. Une étude récente montre que lorsqu'elle est exposée à des conditions pauvres en nutriments, Lm perd sa forme en bâtonnet pour devenir ronde en raison de la perte de sa paroi cellulaire. Ces formes sans paroi cellulaire (cell wall-deficient, CWD) peuvent s'adapter aux déséquilibres physico-chimiques en modifiant leur membrane et en produisant des protéines spécifiques. La première partie de la thèse explore les interactions hôte-pathogène lors d'infections par Lm, en se focalisant sur les cellules trophoblastiques. À l'aide de la protéomique comparative par spectrométrie de masse (LC-MS/MS), cette étude compare les profils de sécrétome des cellules infectées et non infectées durant les phases réplicative (24h p.i.) et persistante (96h p.i) de l'infection. L'analyse des voies métaboliques mises en jeu dans le modèle trophoblastique indique que Lm module les réponses immunitaires par des processus intermédiaires tels que l'angiogenèse et les voies de signalisation, dont HIF-1α et MAPK, essentiels à la transduction du signal. Comme dans le foie, ces modulations pourraient être cruciales pour créer et maintenir une niche dans les cellules trophoblastiques ; cependant, les mécanismes restent à identifier. La seconde partie de la thèse étudie la persistance environnementale de Lm via un modèle in vitro d'eau minérale et une analyse de protéomique comparative. Les données montrent une régulation à la baisse des protéines liées à la paroi cellulaire, en cohérence avec l'établissement de forme CWD. L'analyse fonctionnelle a révélé également des réponses aux stress, notamment une diminution de la transduction des signaux, de la virulence et de la production d'énergie, cohérentes avec l'état VBNC. Ces résultats éclairent les stratégies de survie environnementale de Lm et ses mécanismes de persistance. Ce travail explore la persistance de Lm dans les trophoblastes et l'environnement, montrant son adaptation moléculaire à survivre dans des environnements variés. Dans les cellules hôtes, Lm réprime l'immunité, tandis que, dans des conditions pauvres en nutriments, elle privilégie l'acquisition de nutriments et la résistance aux stress. L'ensemble de ces données soulignent sa résilience et pourrait conduire à des applications potentielles pour détecter et traiter les infections persistantes.

Listeria monocytogenes (Lm) is a facultative intracellular pathogen responsible for listeriosis, a severe foodborne illness in pregnant women and immunocompromised individuals. Known for its adaptability, Lm persists across varied environments, making it difficult to control. During long-term infection in epithelial cells, such as hepatocytes and trophoblasts, Lm shifts from a replicative to a quiescent state within lysosome-like vacuoles, termed Listeria-containing vacuoles (LisCVs). This transition is associated with the loss of the actin-nucleating protein ActA and the arrest of actin polymerisation at the bacterial surface. Within LisCVs, the majority of bacteria remain intact and enter a slow/non-replicative or a viable but non-culturable (VBNC) state, a dormant form enabling persistence under adverse conditions. Prolonged infection of hepatocytes by Listeria disrupts host immunity, particularly reducing the secretion of acute-phase proteins (APPs), key to the immune response. This process might prevent the complete elimination of Listeria from the liver, thereby favoring the establishment of persistent infection. Lm also displays notable adaptability outside host environments, particularly in water systems, where it can enter a VBNC dormant state. VBNC pathogens pose heightened health risks as they are undetectable by growth-based methods and can reactivate into a virulent form. A recent study shows that when exposed to these nutrient-poor conditions, the bacteria lose their rod shape and become round due to their cell wall loss. These cell wall-deficient (CWD) forms can adapt to physicochemical imbalances by modifying their membrane and producing specific proteins. The first part of this thesis explores host-pathogen interactions during Lm infections, focusing on trophoblast cells. Using comparative proteomics via LC-MS/MS, this study analyses differences in secretome profiles between infected and uninfected cells across replicative (24h p.i.) and persistent (96h p.i.) infection phases. Pathway analysis in the trophoblast model indicates that Lm modulates immune responses through intermediary processes like angiogenesis and signalling pathways, including HIF-1α and MAPK, essential for signal transduction. Similar to the liver, these modulations may be crucial for creating and sustaining a niche in trophoblast cells; however, mechanisms remain to be identified. The second part of this thesis investigates Lm environmental persistence using an in vitro mineral water model and comparative proteomics. Proteomic data identified the downregulation of cell wall-related proteins, consistent with the establishment of CWD form. Functional analysis showed additional stress responses, including decreased signal transduction, virulence, and energy production, all consistent with the VBNC state. These findings provide insight into Lm environmental survival strategies, aiding in the understanding of its persistence mechanisms. This work examines Lm persistence in trophoblast cells and environmental conditions, demonstrating its molecular adaptation to survive in diverse environments. Within host cells, Lm emphasises immune repression, while in nutrient-poor conditions, it focuses on nutrient scavenging and stress resistance. These findings highlight its resilience and could lead to potential applications for detection and treatment of persistent infections.

Το Listeria monocytogenes (Lm) είναι ένας προαιρετικά ενδοκυτταρικός παθογόνος μικροοργανισμός, υπεύθυνος για τη λιστερίωση, μια σοβαρή τροφιμογενή λοίμωξη που επηρεάζει κυρίως έγκυες γυναίκες και ανοσοκατασταλμένα άτομα. Γνωστό για την προσαρμοστικότητά του, το Lm επιμένει σε ποικίλα περιβάλλοντα, καθιστώντας τον έλεγχό του δύσκολο. Κατά τη διάρκεια χρόνιων λοιμώξεων σε επιθηλιακά κύτταρα, όπως ηπατοκύτταρα και τροφοβλάστες, το Lm μεταβαίνει από πολλαπλασιασμό σε λανθάνουσα κατάσταση σε Listeria-containing vacuoles (LisCVs). Αυτή η μετάβαση συνδέεται με την απώλεια της ActA και την αναστολή του πολυμερισμού της ακτίνης στην επιφάνειά του. Στα LisCVs, τα βακτήρια εισέρχονται σε μια αργή/μη πολλαπλασιαστική ή βιώσιμη αλλά μη καλλιεργήσιμη (VBNC) κατάσταση, ευνοώντας την επιμονή. Η παρατεταμένη λοίμωξη των ηπατοκυττάρων από τη Listeria διαταράσσει την ανοσία του ξενιστή, μειώνοντας την έκκριση πρωτεϊνών οξείας φάσης (APPs), κρίσιμων για την ανοσοαπόκριση. Αυτό μπορεί να εμποδίσει την πλήρη εξάλειψή της από το ήπαρ, προωθώντας χρόνια λοίμωξη. Το Lm εμφανίζει προσαρμοστικότητα και εκτός ξενιστών, ιδιαίτερα σε υδάτινα συστήματα, όπου εισέρχεται στη VBNC κατάσταση. Οι οργανισμοί VBNC συνιστούν κίνδυνο, καθώς δεν ανιχνεύονται με μεθόδους καλλιέργειας αλλά μπορούν να επανενεργοποιηθούν. Πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι σε συνθήκες πτωχών θρεπτικών στοιχείων, τα βακτήρια χάνουν το ραβδοειδές σχήμα τους και γίνονται στρογγυλά λόγω απώλειας κυτταρικού τοιχώματος. Αυτές οι μορφές χωρίς κυτταρικό τοίχωμα (CWD) προσαρμόζονται σε φυσικοχημικές ανισορροπίες μέσω τροποποιήσεων στη μεμβράνη και παραγωγής ειδικών πρωτεϊνών. Το πρώτο μέρος αυτής της διατριβής εξετάζει τις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου στις λοιμώξεις Lm, εστιάζοντας στα κύτταρα τροφοβλάστης. Με συγκριτική πρωτεομική (LC-MS/MS), αναλύονται οι διαφορές στο εκκρίτωμα μολυσμένων και μη μολυσμένων κυττάρων στις φάσεις πολλαπλασιασμού (24h) και επιμονής (96h). Η ανάλυση μονοπατιών δείχνει ότι το Lm τροποποιεί τις ανοσολογικές αποκρίσεις μέσω διαδικασιών όπως η αγγειογένεση και τα μονοπάτια σηματοδότησης HIF-1α και MAPK, κρίσιμα για τη μεταβίβαση σήματος. Όπως και στο ήπαρ, αυτές οι τροποποιήσεις μπορεί να συμβάλλουν στη διατήρηση μιας λοίμωξης στα κύτταρα τροφοβλάστης, αν και οι ακριβείς μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι. Το δεύτερο μέρος εξετάζει την περιβαλλοντική επιμονή του Lm χρησιμοποιώντας in vitro μοντέλο μεταλλικού νερού και συγκριτική πρωτεομική. Τα δεδομένα ανέδειξαν μείωση πρωτεϊνών κυτταρικού τοιχώματος, επιβεβαιώνοντας τη μορφή CWD. Επιπλέον, η λειτουργική ανάλυση έδειξε αποκρίσεις στο στρες, όπως μείωση μεταβίβασης σήματος, λοιμογόνου δράσης και παραγωγής ενέργειας, συμβατές με την κατάσταση VBNC. Αυτά τα ευρήματα προσφέρουν νέα δεδομένα για τις στρατηγικές περιβαλλοντικής επιβίωσης του Lm, συμβάλλοντας στην κατανόηση των μηχανισμών επιμονής του. Η εργασία αυτή εξετάζει την επιμονή του Lm σε κύτταρα τροφοβλάστης και περιβαλλοντικές συνθήκες, καταδεικνύοντας τη μοριακή του προσαρμογή. Στα κύτταρα ξενιστή, το Lm καταστέλλει το ανοσοποιητικό, ενώ σε συνθήκες πτωχών θρεπτικών στοιχείων εστιάζει στη συλλογή τους και την αντοχή στο στρες. Αυτά τα ευρήματα αναδεικνύουν την ανθεκτικότητά του και θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανίχνευση και θεραπεία επίμονων λοιμώξεων.