Lipidomique du globule rouge par des techniques de spectrométrie de masse et d'imagerie infrarouge : Application à l'étude de la maladie de Gaucher

Lipidomics of red blood cells by mass spectrometry and infrared imaging techniques : Application to the study of Gaucher's disease

• Auteur / Autrice : Terkia Bettioui
• Direction : Marine de Person
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 04/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie physique (Orsay, Essonne ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté des sciences d’Orsay (Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Guillaume Van der Rest
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît Maunit, Olivier Piot, Mélanie Franco, Bérengère Claude
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Benoît Maunit, Olivier Piot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gaucher, Maladie de

Analyse multiéchelle

Microscopie à force atomique

Spectrométrie de masse avec ionisation électrospray

Sphingolipides

Phospholipides

Érythrocytes

Mots clés libres

Globule rouge

Phosphilipides

Sphingolipides

SPE-HPLC-MS/MS

Profilage semi-ciblé

AFM-IR

Approche multi-échelles.

Red blood cells

Phosphilipids

Sphingolipids

SPE-HPLC-MS/MS

Semi-targeted profiling

AFM-IR

Multiscale approach

Résumé

Les globules rouges suscitent un intéret clinique particulier en raison de leur importance biologique. Il a été récemment démontré que certaines pathologies érythrocytaires pouvaient être associées à une composition lipidique anormale. Parmi ces pathologies figure la maladie de Gaucher, un trouble lysosomal rare causé par une déficience en β-glucocérébrosidase, enzyme dont l'absence entraîne une accumulation excessive de certains sphingolipides dans l'organisme. Cette surcharge lipidique altère les propriétés morphologiques et rhéologiques des globules rouges, provoquant des anomalies hématologiques et vasculaires.Dans cette thèse, nous avons étudié le lien entre la composition lipidique des globules rouges et son implication dans la maladie de Gaucher. En particulier, nous nous sommes concentrés sur deux catégories de lipides : les sphingolipides et les phospholipides, qui jouent un rôle clé dans les altérations érythrocytaires observées. Deux approches complémentaires ont été utilisées : la première utilise la spectrométrie de masse dans le but d'identifier de nouveaux biomarqueurs. La seconde exploite des techniques d'imagerie infrarouge à différentes échelles pour étudier la répartition des lipides dans les globules rouges.Nous avons mis au point une méthode rapide de préparation d'échantillons en ligne avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (SPE-HPLC-MS/MS), pour doser 30 sphingolipides et phospholipides en moins de 15 min. Par la suite cette méthode a été appliquée pour quantifier les 30 espèces lipidiques dans le plasma et le culot globulaire de sujets contrôles et de patients Gaucher. Parmi ces espèces lipidiques, certaines étaient surexprimées et n'étaient pas associées à la maladie de Gaucher, ouvrant de nouvelles perspectives pour le diagnostic et le suivi thérapeutique.A l'issue de ce dosage nous nous sommes intéressés à l'exploration du lipidome du globule rouge sain pour pouvoir le comparer à celui du globule rouge Gaucher. Pour cela une approche semi-ciblée a été menée en utilisant un analyseur triple quadripolaire. Ceci nous a permis d'identifier plus de 266 espèces moléculaires réparties sur 12 classes lipidiques différentes.Ces résultats ont contribué à une meilleure connaissance du lipidome du globule rouge sain et sont prometteurs pour l'identification de nouveaux biomarqueurs et la compréhension de diverses pathologies affectant le lipidome érythrocytaire.En complément de cette approche, nous avons étudié la morphologie et la composition chimique des globules rouges en utilisant des techniques d'imagerie vibrationnelle infrarouge à différentes résolutions : à l'échelle microscopique avec la microspectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (μ-FTIR), à l'échelle submicronique avec l'imagerie optique thermique (O-PTIR) et à l'échelle nanométrique grâce à l'AFM-IR.Cette étude a été réalisée en trois étapes principales : (1) l'élaboration d'un protocole de préparation permettant la fixation des globules rouges, (2) l'évaluation de leur stabilité chimique et morphologique, et enfin (3) une analyse multi-échelles comparant des globules rouges sains à ceux affectés par la maladie de Gaucher.Grâce à notre protocole de fixation, nous avons pu préserver les globules rouges sans altération pendant 10 jours, ce qui nous a permis de mener à bien l'analyse multi-échelle. L'AFM-IR s'est révélée être la seule technique capable de mettre en évidence des différences significatives entre les globules rouges sains et Gaucher. L'AFM-IR a permis de visualiser les différentes morphologies des cellules Gaucher et de comparer la distribution des lipides à travers des cartographies chimiques, révélant des zones d'intérêt au niveau de la membrane érythrocytaire.

Red blood cells attract particular clinical interest due to their biological significance. It has recently been demonstrated that certain erythrocyte pathologies may be associated with abnormal lipid composition. Among these pathologies is Gaucher's disease, a rare lysosomal disorder caused by a deficiency in β-glucocerebrosidase, an enzyme whose absence leads to excessive accumulation of certain sphingolipids in the body. This lipid overload alters the morphological and rheological properties of red blood cells, causing hematological and vascular abnormalities.In this thesis, we studied the link between the lipid composition of red blood cells and its implication in Gaucher's disease. In particular, we focused on two categories of lipids: sphingolipids and phospholipids, which play a key role in the erythrocyte alterations observed. Two complementary approaches were used: the first uses mass spectrometry with the aim of identifying new biomarkers. The second uses infrared imaging techniques at different scales to study the distribution of lipids in red blood cells.We developed a rapid sample preparation method compatible with liquid chromatography coupled to mass spectrometry (SPE-HPLC-MS/MS) to quantify 30 sphingolipids and phospholipids in less than 15 minutes. This method was then applied to quantify the 30 lipid species in the plasma and red blood cell pellet of control subjects and Gaucher patients Among these lipid species, some were overexpressed and were not associatedAfter this quantification, we focused on exploring the lipidome of healthy red blood cells and comparing it to that of Gaucher red blood cells. To achieve this, a semi-targeted approach was conducted using a triple-quadrupole analyzer, which allowed us to identify more than 266 molecular species spread across 12 different lipid classes.These results have contributed to a better understanding of the lipidome of healthy red blood cells and are promising for the identification of new biomarkers and the diagnosis of various pathologies affecting the erythrocyte lipidome.As a complement to this approach, we focused on the morphological and chemical study of red blood cells using vibrational infrared imaging techniques at different resolutions: microscopic with Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), submicron with optical photothermal infrared imaging (O-PTIR), and nanometric with atomic force microscopy (AFM-IR).Our study was structured around three steps: (1) developing a preparation protocol allowing the fixation of red blood cells, (2) evaluating their chemical and morphological stability, and finally (3) conducting a multi-scale analysis comparing healthy red blood cells with those affected by Gaucher's disease.Due to our fixation protocol, we were able to preserve red blood cells without degradation for 10 days, which enabled us to successfully conduct the multi-scale analysis. AFM-IR proved to be the only technique capable of highlighting significant differences between healthy and Gaucher red blood cells. AFM-IR allowed us to visualize the distinct morphologies of Gaucher cells and to compare lipid distribution through chemical mapping, revealing areas of interesting in the erythrocyte membrane.