Développement de sondes moléculaires agissant sur l'interface Tau / Tubuline et alpha-Synucléine / Tubuline

Development of molecular probes acting on Tau/Tubulin and a-Synuclein/Tubulin interface

• Auteur / Autrice : Kaliroi Peqini
• Direction : Sandrine Ongeri, Julia Kaffy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences pharmacologiques
• Date : Soutenance le 11/07/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay en cotutelle avec Università degli studi (Milan, Italie). Dipartimento di Scienze della Terra
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biomolécules : conception, isolement, synthèse (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2002-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alessandro Moretto, Sergio Dall'angelo, Françoise Ochsenbein, Giulio Vistoli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alessandro Moretto, Sergio Dall'angelo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Alpha-synucléine

Protéine tau

Maladies neurodégénératives

Tubulines

Microtubules

Mots clés libres

Alpha-Synucléine

Tau

Tubuline

Tubulin

Tau

A-Synuclein

Résumé

Les microtubules (MT) sont des structures omniprésentes jouant de nombreux rôles dans tous les types de cellules eucaryotes, des champignons aux mammifères, principalement constitués d'hétérodimères de tubuline α/β conservés. Les neurones sont un exemple impressionnant de cellules dans lesquelles la contribution des MT est fondamentale pour réaliser leur architecture cellulaire sophistiquée et pour maintenir leur complexité fonctionnelle. Un nombre croissant de preuves indiquent que les défauts des microtubules sont liés à des maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson (MP). Plusieurs études indépendantes rapportent une association cruciale à l'échelle du génome avec la MP de polymorphismes nucléotidiques simples dans le locus MAPT, contenant le gène codant pour la protéine Tau, une protéine de liaison aux microtubules qui est principalement exprimée dans les neurones. La preuve de la pathologie Tau dans la MP est frappante et contribue au dysfonctionnement neuronal, à l'altération du transport axonal et à la mort cellulaire sous-jacente à la MP. Récemment, une autre protéine, l'α-Synucléine (αSyn), a été mise à l'honneur par divers groupes de recherche depuis qu'elle a été trouvée agrégée dans le cerveau des patients parkinsoniens. αSyn, composé de 140 acides aminés, est en fait profondément impliqué dans la MP, car i) c'est le composant principal des corps de Lewy, qui sont bien connus comme la marque histopathologique de la MP et ii) le gène qui le code, SCNA, est muté dans la MP familiale. Même si de nombreuses nouvelles informations concernant à la fois αSyn/tubuline et Tau/tubuline ont été obtenues, leur pertinence par rapport au dysfonctionnement neuronal reste encore incertaine. Pour ces raisons, leur interaction est placée au centre de mon projet de recherche.Le premier objectif principal de cette thèse est le développement de sondes moléculaires à base de peptides capables de moduler l'interaction Tau et α-Synucléine avec la tubuline. Une bibliothèque de peptides, à la fois des séquences natives et mutées de αSyn, a été synthétisée et utilisée comme « outils » moléculaires pour la conduite d'expériences in vitro. La structure secondaire des peptides a été caractérisée afin d'avoir une meilleure idée de leurs possibles activités lors des expériences in vitro. La thermophorèse à l'échelle microscopique (MST) et le test de polymérisation de la tubuline ont été utilisés en utilisant ces peptides, dans des conditions proches des conditions physiologiques. D'après des données préliminaires, deux mutants semblaient affecter la polymérisation de la tubuline in vitro et dans une lignée cellulaire spécifique. De plus, nous avons également cherché à stabiliser une conformation secondaire dans les peptides précédemment synthétisés, en conséquence une bibliothèque de peptides conformationnellement stables a été synthétisée afin d'obtenir des peptides stables en hélice α. Leur structure secondaire a été évaluée via des expériences CD et AT-IR. En conclusion, nous pourrions souligner que les séquences αSyn ont tendance à être difficiles à caractériser conformationnellement puisqu'il s'agit d'une protéine intrinsèquement désordonnée, et dans notre cas, les stratégies d'agrafage ont complètement réussi. Nous avons donc exploré une approche d'agrafage moins courante, en concevant également un nouveau lieur pour permettre l'agrafage. Malheureusement, notre liaison n'était pas stable dans les conditions SPPS standard. Enfin, deux peptides dérivés de Tau ont été synthétisés afin d'être utilisés comme outils moléculaires pour détecter leur site de liaison sur la tubuline. Les deux peptides ont ensuite été examinés par nos collègues du PSI, en Suisse, dans des expériences de trempage et de co-cristallisation. Les résultats n'ont pas été communiqués.

Microtubules (MTs) are ubiquitous structures playing many roles in all eukaryotic cell types from fungi to mammals mainly consisting of conserved α/β tubulin heterodimers. Neurons are an impressive example of cells in which the contribution of MTs is fundamental to achieve their sophisticated cell architecture and to sustain their functional complexity. A growing body of evidence, indicate that microtubules defects are linked to neurodegenerative diseases, such as Parkinson's Disease (PD). Several independent studies report a genome-wide crucial association with PD of single nucleotide polymorphisms in the MAPT locus, containing the gene coding for the Tau protein, a microtubule-binding protein that is predominantly expressed in neurons. The evidence of Tau pathology in PD is striking and contributes to neuronal dysfunction, impairment of axonal transport and cell death underlying PD. Recently another protein, α-Synuclein (αSyn), was put in the spotlight of various research groups since it was found aggregated in PD patients' brains. αSyn, composed of 140 amino acids, is in fact deeply involved in PD, as i) it is the main component of Lewy bodies, which are well-known as the histopathological hallmark of PD and ii) the gene that encodes it, SCNA, is mutated in familial PD. Even though, lots of new information regarding both αSyn/tubulin and Tau/tubulin have been obtained, their relevance over neuronal dysfunction still remains unclear. For these reasons, their interaction is set at the center of my research project. The first main aim of this PhD is the development of peptide based molecular probes able to modulate the Tau and α-Synuclein interaction with Tubulin. A library of peptides, both native and mutated sequences of αSyn, were synthesized and were used as molecular ‘tools' for the conduction of in vitro experiments. The secondary structure of the peptides was characterized so to have a better idea of their possible activities during the in vitro experiments. Microscale Thermophoresis (MST) and the tubulin polymerization assay were employed using these peptides, in conditions which were approximate to the physiological ones. From preliminary data, two mutants, seemed to affect the polymerization of tubulin in vitro and in a specific cell line. Moreover, we also aimed to stabilize a secondary conformation in the previously synthesized peptides, as a result a library of conformationally stable peptides was synthesized in order to obtain α-helically stable peptides. Their secondary structure was evaluated via CD and AT-IR experiments. As conclusion we could highlight that αSyn sequences tend to be difficult to be characterized conformationally since it is an intrinsically disordered protein, and in our case stapling strategies were completely successful. We, therefore, explored a less common stapling approach, by also designing a novel linker to afford the stapling. Unfortunately, our linked was not stable in standard SPPS conditions. Finally, Two Tau-deriving peptides were synthesized in order to be used as molecular tools to detect their binding site on tubulin. The two peptides were then examined by our co-workers in PSI, Switzerland in soaking and co-crystallization experiments. The results have not been reported.