Utilisation de peptidomimétiques adoptant des structures en brin β ou en épingle à cheveux β induites par des acides aminés contraints pour moduler l'agrégation de la protéine associée aux microtubules Tau : conception, synthèse et évaluation

Using β-strand and β-hairpin peptidomimetics induced by constrained amino acids to modulate the aggregation of the microtubule associated protein Tau : design, synthesis and evaluation

• Auteur / Autrice : Davide Di Lorenzo
• Direction : Sandrine Ongeri, Nicolo Tonali
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie médicinale
• Date : Soutenance le 04/07/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay en cotutelle avec Università degli studi (Milan, Italie). Convegno di studi (2000 ; Milano)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biomolécules : conception, isolement, synthèse (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2002-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Norbert Sewald
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florine Cavelier, Sophie Lecomte, Thomas Boddaert, Paola Conti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florine Cavelier, Sophie Lecomte
• DOI : 10.70675/0bdac871z5f25z4b5az9467z96a6d16ffb34

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine tau

Tauopathies

Maladie d'Alzheimer

Inhibiteurs

Molécules chaperonnes

Mots clés libres

Agrégation de Tau et maladie d'Alzheimer

Protéine chaperonne Hsp90

Foldamères peptidomimétiques

Brins β et mimes d'épingles à cheveux

Β2.2-Isosaxoline

Inhibiteurs d'agrégation

Tau aggregation and Alzheimer's diasease

Chaperone protein Hsp90

Peptidomimetics foldamers

Hairpin mimics and β-Strands

Aggregation inhibitors

Β2.2-Isosaxoline

Résumé

Les tauopathies sont des troubles neurodégénératifs caractérisés par la présence d'agrégats anormaux de la protéine Tau, conduisant à la formation de dégénérescences neurofibrillaires (NFT) dans les neurones. Tau, une protéine associée aux microtubules (MT), joue un rôle crucial dans la régulation de la dynamique des MT et facilite le transport axonal. La maladie d'Alzheimer (MA) se caractérise par des interactions anormales protéine-protéine (PPI) qui entraînent l'accumulation de plaques β-amyloïdes et de NFT de Tau hyperphosphorylée. De nombreuses preuves suggèrent que l'interaction entre Tau et Aβ contribue à l'aggravation de la maladie car l'agrégation d'une protéine peut déclencher l'agrégation de l'autre. Dans cette thèse, nous avons exploré la possibilité de créer des peptidomimétiques capables de stabiliser soit une structure en épingles à cheveux (β -hairpin) soit une structure étendue pour moduler l'agrégation de Tau. Ce travail se concentre sur trois unités peptidomimétiques distinctes dans le but de mettre en évidence le rôle significatif de la structure secondaire dans la régulation sélective des PPI physiologiques et pathologiques de Tau.L'utilisation d'un mime de coude β piperidine-pyrroline précédemment développé, a conduit à des peptidomimétiques très efficaces comme inhibiteurs duals ciblant Tau et Aβ1-42, mais sans activité sur hIAPP. Ces composés ont été conçus soit sur la base des PPIs de Tau, en imitant son auto-interaction dans les NFT ou son interaction physiologique avec les MTs, soit sur des petites séquences de la protéine chaperonne Hsp90, qui est un inhibiteur physiologique de l'agrégation de Tau. À travers différentes analyses, incluant la stabilité protéolytique, la fluorescence ThT, la viabilité cellulaire et l'imagerie cellulaire en direct FDAP, nous avons démontré le rôle crucial des structures pré-organisées en β-hairpin pour atteindre une activité puissante et sélective et une stabilité. Le composé mimant l'interaction Hsp90-Tau est le plus puissant, et la titration par RMN de 15N-Tau a fourni des informations précieuses sur le mécanisme d'action possible de Hsp90 sur Tau.Ensuite, l'utilisation de l'unité β-2,2-isoxazoline dans une séquence peptidique a été utilisée pour stabiliser deux structures secondaires différentes, soit en β -hairpin, soit étendue. Ces structures ont été confirmées par une combinaison d'analyses CD, IR et RMN dans des solvants aqueux. La structure stabilisée en β -hairpin a été utilisée pour développer notre inhibiteur le plus puissant de l'agrégation de Tau basée sur la protéine Hsp90. La structure étendue portant les séquences PHF6 et PHF6* (impliquées à la fois dans les processus physiologiques et pathologiques de Tau) a été utilisée pour démontrer que l'exposition de ces séquences sur la protéine Tau déclenche son agrégation. En revanche, la conformation en β -hairpin avec les mêmes séquences n'a pas induit d'agrégation pathologique.Enfin, le développement de nouveaux triazoles difluorés et leur incorporation dans des inhibiteurs peptidiques existants de Tau ont permis d'améliorer leur efficacité, comme le démontrent les analyses ThT et l'imagerie FDAP, probablement en raison de leurs propriétés physicochimiques liées à la présence des atomes de fluor.En résumé, ces travaux de doctorat fournissent une preuve de concept selon laquelle les mimes pré-structurés en β -hairpin constituent une base solide pour le développement d'inhibiteurs innovants de l'agrégation de Tau et d'Aβ. La stratégie de mimétisme des chaperonnes a démontré son efficacité pour obtenir l'inhibiteur dual le plus puissant, et en fournissant de plus une nouvelle sonde pour étudier les interactions physiologiques entre Tau et Hsp90. L'inclusion de l'acide aminé β2,2-isoxazoline dans la séquence peptidique a permis de démontrer que la conversion de Tau vers une conformation étendue, entrainant l'exposition de PHF6* et PHF6, est l'événement déclencheur conduisant à l'auto-assemblage de Tau.

Tauopathies refer to neurodegenerative disorders characterized by the presence of abnormal aggregates of Tau protein, leading to the formation of neurofibrillary tangles (NFTs) within neuronal cells. Tau, a protein associated with microtubules (MTs), plays a crucial role in regulating the dynamics of MTs and facilitating proper axonal transport in neurons. Alzheimer's disease (AD) is characterized by abnormal protein-protein interactions (PPIs) which lead to the accumulation of β-amyloid plaques and hyperphosphorylated Tau (P-tau) NFTs. Multiple evidence has suggested that the interplay between Tau and Aβ contribute to worsening the disease since the aggregation of one protein can trigger the aggregation of the other.Within this thesis, we have explored, for the first time, the possibility of creating peptidomimetics capable of stabilizing either a β-hairpin or an extended structure to modulate Tau protein aggregation. This work focuses on three distinct peptidomimetic units with the goal of highlighting the significant role of secondary structure in the selective regulation of both physiological and pathological PPIs of Tau.The utilization of a previously developed piperidine-pyrroline β-turn mimic has led to highly effective peptidomimetics that act as dual inhibitors targeting both Tau and Aβ1-42 proteins but show no activity on the other amyloid protein hIAPP. These compounds were designed either on Tau PPIs, by mimicking its self-interaction in NFTs or its physiological interaction with MTs; or on small sequences of the chaperone protein Hsp90, which is a physiological Tau aggregation inhibitor: Through various analyses, including proteolytic stability, ThT fluorescence, cell viability (LDH and MTT), and live cell imaging FDAP assays, we have demonstrated the critical role of pre-organized hairpin structures in achieving potent activity, selectivity, and stability. Among the designed compounds, the one mimicking Hsp90-Tau- interaction showed the highest potency, and NMR titration with 15N-Tau protein provided valuable insights into the possible mechanism of action of Hsp90 on Tau.Then, the employment of the non-natural β-2,2-isoxazoline unit into a peptide sequence was used to stabilize two different secondary structures, either in β-hairpin or extended. These structures were confirmed through a combination of CD, IR, and NMR analyses in aqueous solvents. The stabilized hairpin structure was used to develop our most potent inhibitor of Tau aggregation by mimicking Hsp90 protein. The extended structure bearing the PHF6 and PHF6* sequences (both involved in the physiological and pathological processes of Tau), was used to prove that it is the exposure of these sequences on Tau protein the event triggering its aggregation. As a counter-test, the hairpin conformation with the same sequences, did not induce any pathological aggregation.Finally, the development of new difluorinated triazoles and their incorporation into existing peptide inhibitors of Tau, led to enhance their effectiveness, as demonstrated by ThT and live cell FDAP imaging, possibly because of their increased pharmacokinetic properties driven by the presence of the fluorine atoms.In summary, the findings presented in this thesis provide a proof of concept that pre-structured hairpin mimics serve as a solid foundation for the development of innovative inhibitors of Tau and Aβ aggregation. The chaperone mimicry strategy has demonstrated its remarkable efficacy being the most potent dual inhibitor and, providing at the same time a new probe to simplify and study Tau-Hsp90 physiological interactions. The inclusion of the β-2,2-isoxazoline amino acid into the peptide sequence allowed to demonstrate that the conversion of Tau toward an extended conformation, with the consequent exposure of PHF6* and PHF6, is the triggering event leading to Tau self-assembly.