Développement de vecteurs adéno-associés recombinants ciblant le muscle pour le transfert de gène et d'approches d'édition du génome pour la myopathie de Duchenne

Development of recombinant adeno-associated vectors targeting muscle for gene transfer and genome editing approaches for Duchenne muscular dystrophy

• Auteur / Autrice : Juliette Lemoine
• Direction : Isabelle Richard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 23/03/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares (Evry, Essonne) - Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Sylvain Fisson
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Capucine Trollet, Denis Furling, Jocelyn Laporte
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Capucine Trollet, Denis Furling

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dystrophine

CRISPR-Cas9

Dependovirus

Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne

Mots clés libres

Virus adéno-Associés

Microdystrophine

Duchenne Muscular Dystrophy

Adeno-Associated virus

Microdystrophin

CRISPR/Cas9

Résumé

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique rare, causée par des mutations dans le gène DMD codant pour la protéine dystrophine. Cette maladie se traduit par une dégénérescence musculaire caractérisée par un affaiblissement progressif des muscles squelettiques, respiratoires et cardiaque. Il n'existe pas de traitement curatif pour les patients à l'heure actuelle. La thérapie génique constitue un espoir de traitement, par le transfert de gène de la microdystrophine et l'édition du génome. Cependant, le transfert de gène par vecteurs adéno-associés recombinants (AAVr) est associé à de la toxicité hépatique d'une part, et à un coût de production élevé d'autre part. Ce travail de thèse a eu pour but de développer des AAVr de thérapie génique ciblant les muscles squelettiques et cardiaque tout en évitant de cibler le foie. Les AAVr ont été modifiés par ajout de peptides spécifiques aux muscles à la surface de leur capside. Cette approche a permis de sélectionner une capside candidate, qui a par la suite été utilisée pour le transfert de la microdystrophine. Les résultats obtenus in vivo chez les souris modèles de la myopathie de Duchenne (Dmdmdx) ont montré un transfert de gène efficace de la microdystrophine dans les muscles et réduit dans le foie, corrélé avec une restauration de la force des souris traitées. Un autre aspect de la thèse a visé à développer des approches d'édition du génome sur des cellules de patients DMD atteints de différentes duplications d'exons, à l'aide de l'utilisation d'un ARN guide simple avec le système CRISPR/Cas9. Cette approche a permis de restaurer le cadre de lecture du gène, l'expression d'une dystrophine entière. La fonctionnalité de la dystrophine dans les lignées cellulaires générées reste toutefois à être prouvée.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rare genetic disease, which is caused by mutations in the DMD gene, coding for the dystrophin protein. This disease results in muscle degeneration characterized by a progressive weakening of the skeletal and cardiac muscles and affecting both the respiratory and cardiac functions. To date, there is no cure for DMD patients. Lately, gene therapy through recombinant adeno-associated vectors (rAAV)-mediated transfer of micro-dystrophin, a shortened version of the dystrophin gene, have provided hope for better treatments. However, the need for high doses of recombinant viruses to obtain a therapeutic effect have been associated with liver toxicity, as well as high production costs. The aim of this thesis was to develop novel rAAVs targeting specifically the skeletal and cardiac muscles, all while de-targeting the liver.The rAAVs were modified by adding muscle-specific peptides to their capsid surface. This approach allowed for the selection of one candidate capsid. The selected rAAV capsid was then used for the transfer of microdystrophin in a DMD mouse model (Dmdmdx). Our results showed efficient infection of muscle tissue and reduced infection of the liver. The high transgene expression in the muscle correlated with a restored muscle strength in the treated mice. Another goal of the thesis was to develop genome editing approaches to restore a functional dystrophin expression in human immortalized myoblasts from DMD patients carrying different exon duplications in the DMD gene. Using a simple guide RNA with a CRISPR/Cas9 system, our approach allowed to restore the reading frame in the gene, and the expression of the dystrophin protein in differentiated myotubes. However, the functionality of the restored dystrophin in these cells remain to be assessed.