Contrôle optogénétique pour la production de bêta-carotène chez Saccharomyces cerevisiae à différentes échelles de culture

Optogenetics at different culture scales for beta-carotene bioproduction control in Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Sylvain Pouzet
• Direction : Pascal Hersen
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique, omiques, bioinformatique et biologie des systèmes
• Date : Soutenance le 09/03/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Matière & Systèmes Complexes (Paris ; 2001-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Lemaire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Lemaire, Damien Coudreuse, Stéphanie Heux, Véronique Albanèse
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Damien Coudreuse, Stéphanie Heux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Appareils et instruments scientifiques

Ingénierie métabolique

Carotènes

Saccharomyces cerevisiae

Optogénétique

Mots clés libres

Optogénétique

Bioproduction

Levure

Saccharomyces cerevisiae

Bêta-carotène

Biologie synthétique

Ingénierie métabolique

Instrumentation

Optogenetics

Bioproduction

Yeast

Saccharomyces cerevisiae

Beta-carotene

Synthetic biology

Metabolic engineering

Instrumentation

Résumé

Bien que les possibilités quant à la bioproduction s'élargissent, cette biotechnologie souffre encore de faibles rendements, limitant la compétitivité économique de ces procédés. Outre l'ingénierie métabolique des microorganismes, de nombreuses études visent à mieux contrôler les microorganismes pour maximiser leur potentiel de production. En effet, la production d'une molécule hétérogène déclenche souvent une charge cellulaire. Pour cela, il devient crucial de réguler activement la production et la croissance cellulaire afin de minimiser les échappements évolutifs et de mieux gérer l'allocation des ressources cellulaires. Pour cela, des outils de contrôle versatiles sont nécessaires et l'optogénétique, c'est-à-dire l'utilisation de la lumière pour contrôler des processus biologiques, apparaît comme un système idéal pour contrôler de manière réversible et dynamique le métabolisme cellulaire. Afin d'appliquer l'optogénétique à la bioproduction, des appareils de culture cellulaire pouvant illuminer les cellules sont nécessaires à chaque étape du processus de développement de nouvelles souches. Cependant, comment l'échelle de culture, les conditions de culture et les caractéristiques dépendantes à chaque appareil influencent l'activation optogénétique et son impact sur la bioproduction reste à explorer. Pour répondre à cette question, nous avons construit et implémenter une possibilité d'illumination à divers appareils de culture de laboratoire, avec un accent particulier sur l'éclairage de plaques multipuis, des tubes de culture, d'erlenmeyers, et en rendant eVOLVER, une plate-forme de culture contrôlable à haut débit, utilisable pour l'optogénétique (chapitre 1). Nous avons ensuite construit une souche de levure Saccharomyces cerevisiae dont la production de bêta-carotène est régulée par optogénétique, détaillée dans le chapitre 2. Pour cela, nous avons utilisé un système optogénétique basé sur EL222, un facteur de transcription activé par la lumière bleue, et la voie hétérologue du bêta-carotène. En tant que terpène, reposant sur la voie du mevalonate, un voie métabolique clé pour la production de nombreux autres composés à haute valeur ajoutée, et sa couleur orange vif, le bêta-carotène est un modèle de bioproduction idéal. Pour contrôler la production de bêta-carotène par optogénétique, l'enzyme CrtYB a été placée sous contrôle du promoteur optogénétique pC120. Ainsi, le gène ne s'exprime qu'en présence de lumière bleue et agit comme valve de contrôle de production, tandis que les autres gènes de la voie du bêta-carotène sont exprimés constitutivement. Dans le chapitre 3, pour tester les performances de cette souche à travers les échelles de culture et comprendre l'influence des paramètres de culture, nous avons procédé en 3 étapes. Premièrement, l'activation optogénétique a été caractérisée et optimisée dans chaque appareil, démontrant que l'activation dépendait fortement de la modalité d'éclairage et devait être optimisée pour être comparable entre appareils. Deuxièmement, la production, constitutive, de bêta-carotène a également été optimisée indépendamment dans chaque appareil : pour maximiser la production, le volume de culture et l'agitation s'avérèrent critiques. Enfin, dans un troisième temps, la souche productrice de bêta-carotène contrôlée optogénétiquement a été validée et comparée entre appareils. Dans ce manuscrit, nous présentons et discutons le développement d'instruments optogénétique laboratoire, notamment concernant l'implémentation de l'illumination, le volume de culture, du débit expérimental et de la contrôlabilité. Nous avons montré comment rendre un système génétique de bioproduction contrôlable optogénétiquement et détaillé ses limitations. Ici, nous relions alors des considérations techniques et des connaissances biologiques pratiques dans l'espoir d'atteindre une meilleure contrôlabilité, ouvrant la voie à des processus de bioproduction optogénétiquement contrôlés à plus grande échelle.

As bioproduction possibilities expand, this biotechnology still suffers from low yields, making many processes not yet economically viable. Besides strain metabolic engineering, many studies aim at better controlling microorganisms to maximize their production potential. Indeed, as production often triggers cell burden, it became crucial to be able to regulate production and growth to reduce evolutionary escape and better manage cell resources allocation. For this, versatile control tools are needed and optogenetics, i.e., using light to control biological processes, emerges as a convenient system to reversibly and dynamically control cell metabolism. In order to apply optogenetics to bioproduction, illumination culture devices are needed for every step of the strain development process, but it remains unclear how culture scale, culture conditions and device dependent characteristics influence optogenetic activation and how it impacts the resulting production. To address this question, we built and adapted various lab-scale illumination culture devices, with a particular emphasis on illuminating imaging well-plates, test tubes, flasks, and adapting the eVOLVER, a high throughput highly controllable culture platform, to carry out optogenetic batch cultures (chapter 1). We then built a Saccharomyces cerevisiae strain in which beta-carotene production is regulated by optogenetic, detailed in chapter 2. For this, we used the EL222 optogenetic system, a single-component transcription factor that is activated by blue light, and the beta-carotene heterologous pathway. As a terpene resting on the mevalonate pathway, a key pathway for the production of many other high value-added compounds, and its vivid orange color, beta-carotene is an ideal bioproduction model. To control beta-carotene production using optogenetic, the CrtYB enzyme of the pathway was placed under the control of the pC120 optogenetic promoter such that this gene will only be expressed in the presence of blue light, acting as a valve to control production, while other genes of the beta-carotene pathway are expressed constitutively. In chapter 3, to test how this strain's performance would translate across culture scales and what key parameters influence it, we proceeded in a 3-step manner. First, optogenetic activation was characterized and optimized in each device, demonstrating that activation was highly dependent on the illumination modality and should be optimized to be comparable between devices. Second, constitutive beta-carotene production was also independently optimized in each device: to maximize production, culture volume and stirring appeared critical. Finally, as a third step, the optogenetically-controlled beta-carotene producer strain was validated and compared across devices. In this manuscript, we present insights for the development of lab-scale optogenetic instruments, discussing light implementation, culture volume, throughput and controllability. We showed how to adapt a bioproduction genetic system to optogenetic and detail its limirations. In definitive, we link technical considerations with practical biological insights in the hope to reach better strain controllability, setting the stage for potential larger scale optogenetically controlled bioproduction processes.