Modélisation in vitro du muscle sur membrane silicone microstructurée par photolithographie UV

In vitro muscle modeling with PDMS micropatterned by UV photolithography

• Auteur / Autrice : Théo Regagnon
• Direction : Pascal Etienne, Stefan Matecki
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique et Astrophysique
• Date : Soutenance le 07/11/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Information, Structures, Systèmes (Montpellier ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Charles Coulomb (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Thomas Trimaille
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mireille Cossée
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Mouly, Chloé Thieuleux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies musculaires

Multiplication in vitro

Photolithographie

Mots clés libres

Microstructuration

Photolithographie UV

Modelisation in vitro

Cellules musculaires humaines

Microstructuration

UV photolithography

In vitro modeling

Primary muscle myoblasts

Résumé

L'objectif du projet de thèse était de mettre au point un modèle in vitro de myotubes humains différenciés et alignés pouvant être soumis à une tension mécanique. Pour cela, un hybride organique-inorganique, l'EETMOS [2-(3,4 epoxycyclohexylethyltrimethoxysilane)] a été microstructuré par photolithographie UV sur une membrane en PDMS. Cela permet de créer un support flexible avec en surface des lignes parallèles entre elles pouvant être ensuite étiré et tout en favorisant l'alignement des myotubes.L'EETMol est le produit de synthèse sol-gel, une méthode de chimie douce, de l'EETMOS en milieu acide. Ce sol est ensuite déposé par spin coating sur la surface préalablement activée par traitement plasma du PDMS. Les lignes sont ensuite tracées par photolithographie UV avec un laser de haute précision. Les supports microstructurés sont ensuite biofonctionnalisés avec des ligands à base de peptides d'adhésion issus de la matrice extracellulaire. Ceux-ci ont été spécialement synthétisés pour présenter des groupements silylés en surface afin de générer des liaisons covalentes avec le PDMS ce qui permet d'assurer une accroche solide des myotubes au support.L'espacement entre les microstructures ainsi que leur hauteur ont été optimisés pour favoriser le développement des myotubes humains. Après optimisation et analyse par immunofluorescence, des myotubes avec un diamètre de 30µm ont été obtenus sur des supports dont la hauteur des microstructures est de 8µm et leur espacement de 75µm.Enfin, un protocole d'étirement mécanique a été mis au point (10% d'amplitude, 1Hz, deux cycles d'une heure d'étirement, deux heures de repos, une heure d'étirement, séparés par 20h de repos). Un effet sur l'expression de facteurs de transcription myogéniques (MoyG) et sur certaines protéines du sarcomère a été observé suggérant un effet positif de ce protocole d'étirement sur la différenciation des myotubes humains.Ce modèle pourrait être utiliser dans le screening de biomolécules ou pour l'évaluation chez des patients, après micro-biopsie, de leur réponse musculaire au stress mécanique.

Our aim was to propose an in vitro model of differentiated and aligned human skeletal myotubes. To this end, we describe the micropatterning on a PDMS [poly(dimethylsiloxane)] substrate of EETMOS [2-(3,4 epoxycyclohexylethyltrimethoxysilane)] an organic-inorganic hybrid polymer to produce a network of parallel lines that can be stretchable to optimize differenciation.The EETMOS-based resin was synthesized by sol-gel process and polymerized using UV-photolithography. Human primary myoblasts were seeded onto the microstructurated substrate to be, after proliferation, stretched to differentiate into aligned myotubes.The effect of the spacing between the parallel lines and their height was assessed by immunofluorescence. After an optimization of the model, we ended up with 30µm large myotubes reached with a 75µm spacing and 8 µm high microstructures. Then we functionalized the silicone with the use of silylated peptide ligands derived from extracellular matrix adhesion proteins to avoid detachment of the myotubes from their support. A stretching protocol was then optimized (10% from L0, 1Hz, two cycles of 1h stretching / 2h rest / 1h stretching with 20h rest in between). An improvement in the expression of sarcomere proteins and myogenic regulatory factors (MyoG) was observed with stretching in relation to better differentiation of the myogenic progeniteur. The in vitro model that we propose would be a very useful tool to evaluate in a patient, from a microbiopsy, his muscular responses to mechanical stress.