Méthodes d'analyse des microcystines totales par LC-MS/MS dans les matrices de poisson et évaluation de leur bioaccessibilité pour le consommateur

Methods of analysis of total microcystins by LC-MS/MS in fish matrices and of evaluation of their bioaccessibility for the consumer

• Auteur / Autrice : Pierre Bouteiller
• Direction : Thierry Guérin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de l'environnement
• Date : Soutenance le 14/09/2023
• Etablissement(s) : Reims
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Stress environnementaux et biosurveillance des milieux aquatiques (Reims, Marne ; Le Havre, Seine-Maritime)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Guérin, Linda Lawton, Vitor Vasconcelos, Elisabeth Faassen, Damien Reveillon, Émilie Lance, Ronel Bire
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Linda Lawton, Vitor Vasconcelos

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Chromatographie en phase liquide

Saumons

Truites

Contamination

Poissons d'eau douce

Eau potable -- Contamination

Cyanobactéries

Toxines

Microcystines

Mots clés libres

Cyanobactéries

Microcystines totales

Bioaccessibilité

Cyanobacteria

Total Microcystins

Bioaccessibility

Résumé

Les microcystines (MC) sont des hépatotoxines produites par diverses cyanobactéries. La prolifération massive de cyanobactéries productrices de MCs peut présenter des effets délétères pour la faune mais aussi pour l'homme en raison de l'exposition, notamment par contact ou par ingestion (eau et organismes aquatiques contaminés). Les MCs peuvent s'accumuler dans les matrices biologiques sous plusieurs formes : libres dans la cellule ou liées de manière covalente à diverses protéines (PPAses, cystéine, glutathion, ...) dans les organismes. Les formes totales de MCs (libres + liées de manière covalente) sont encore rarement surveillées et pourtant elles constituent une forme majeure d'accumulation dans les réseaux alimentaires aquatiques. Ce projet de doctorat vise à i) améliorer les méthodes d'extraction et d'analyse par LC-MS/MS des formes totales de MC dans les tissus d'organismes d'eau douce, ii) évaluer la cinétique d'accumulation des MC libres et liés aux protéines dans la chair et les organes des poissons d'eau douce, iii) développement d'une méthode de digestion statique pour déterminer la bioaccessibilité des MC totales.Trois méthodes d'extraction des formes libres dans la chair de diverses espèces de poissons (saumon, truite et carpe) ont d'abord été comparées en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). La méthode donnant les meilleures récupérations et des effets de matrice comparables pour les deux poissons et les variants de MC testées (MC-LR, MC-RR), ainsi qu'un processus d'exécution rapide et facile, a ensuite été optimisée et validée selon l'approche des critères inspirée de la norme V03-110. Pour les MCs totales, deux protocoles d'oxydation de Lemieux ont été comparés sur différentes matrices fraîches et lyophilisées (poisson et moule d'eau douce). Le protocole le plus récent a donné de meilleurs rendements moyens (66%) que celui couramment utilisé dans la littérature (33%). Différentes méthodes de quantification (courbe d'étalonnage dans le solvant, courbe d'étalonnage adaptée à la matrice et courbe d'étalonnage utilisant le MC-LR oxydé en MMPB, avec ou sans étalon interne) ont également été comparées pour chaque protocole. L'utilisation de l'étalon interne d3-MMPB a donné de meilleurs rendements pour les deux méthodes de Lemieux.La déconjugaison à pH basique a été choisie, non seulement pour sa nouveauté concernant l'analyse des cyanotoxines mais aussi parce que cette technique permet, contrairement à l'oxydation de Lemieux, de conserver l'information sur l'identité des variants de MCs. La déconjugaison a été appliquée aux conjugués MC-protéines (MC-Cys, MC-Gsh) et aux matrices aquatiques avec NaOH [0,5 µM]. Pour éviter la reconjugaison des MC avec les protéines, du borohydrure de sodium [0,4M] a été utilisé pour réduire et obtenir des MC déconjuguées non réactives. Une déconjugaison complète des MC-Gsh a été obtenue après 1 heure de réaction et après 4 heures pour les MC-Cys avec une réduction des MC déconjuguées entre 6 et 22 heures pour les deux types de conjugués.En raison du manque de connaissances sur la cinétique d'accumulation et de dépuration des MCs totaux chez les poissons, une expérience a été menée sur des carpes juvéniles, nourries avec des aliments pour poissons enrichis en MC-LR, pendant 7 jours suivis d'une période de dépuration de 21 jours. Des analyses des MCs totaux par oxydation Lemieux ont été réalisées dans la chair et le foie des carpes exposées à MC-LR mais n'ont pas révélé d'accumulation de MCs.Enfin, un travail préliminaire sur la bioaccessibilité des formes totales de MCs a été réalisé. Le protocole harmonisé de digestion statique INFOGEST a été mis en œuvre en laboratoire et testé sur des moules d'eau douce naturellement contaminées par des MCs.

Microcystins (MCs) are hepatotoxins produced by various cyanobacteria. Massive proliferation of MC-producing cyanobacteria can present deleterious effects for wildlife but also for humans due to exposure, particularly through contact or ingestion (contaminated water and aquatic organisms). MCs can accumulate in biological matrices in several forms: free in the cell or covalently bound to various proteins (PPAses, cysteine, glutathione, …) in organisms. The total forms of MCs (free + covalently bound) are still rarely monitored and yet they are a major form of accumulation in aquatic food webs. This PhD project aimed at i) improving methods of extraction and analysis by LC-MS/MS of total forms of MC in tissues of freshwater organisms; ii) evaluating the kinetics of accumulation of free and protein-bound MCs in freshwater fish flesh and organs, and iii) the development of a static digestion method to determine the bioaccessibility of total MCs.Different methods of extraction of free forms in the flesh of various fish species (salmon, trout and carp) were first compared using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method giving the best recoveries and comparable matrix effects for both fishes and the tested MC variants (MC-LR, MC-RR), as well as a rapid and easy execution process, was further optimized and validated according to the criteria approach inspired from the V03-110 standard. For total MCs, two protocols of the Lemieux oxidation were compared on different fresh and freeze-dried matrices (fish and freshwater mussel). The more recently developed protocol gave better average yields (66%) than the one commonly used in the literature (33%). Different quantification methods (solvent versus matrix-matched calibration curve, calibration curve using MC-LR oxidized to MMPB, with or without internal standard) were also compared on each protocol. The use of the internal standard d3-MMPB gave better yields on both Lemieux methods.Inconveniences inherent to the MMPB oxidation method such as the processing time of each sample, the moderate yields of the method as well as the loss of information on the identity of the MCs have motivated the search for an alternative method for the analysis of total forms of MCs by LC-MS/MS. Deconjugation at basic pH was chosen, not only for its novelty regarding the cyanotoxin analysis but also because this technique allows, unlike the Lemieux oxidation, to keep information on the identity of the MC variants. Deconjugation was applied to MC-protein conjugates (MC-Cys, MC-Gsh) and aquatic matrices with NaOH [0.5 µM]. To avoid reconjugation of MC with proteins, sodium borohydride [0.4M] was used to reduce and to obtain non-reactive deconjugated MCs. A complete deconjugation of MC-Gsh was achieved after 1 hour of reaction and after 4 hours for MC-Cys with reduction of deconjugated MCs between 6 and 22 hours for both types of conjugates.Because of the lack of knowledge on the kinetics of accumulation and depuration of total MCs in fish, an experiment was conducted on juvenile carps, voluntarily fed with fish food spiked with MC-LR, during 7 days followed by a depuration period of 21 days. Analyses of total MCs by Lemieux oxidation were performed in the flesh and liver of carps exposed to MC-LR but did not reveal any accumulation of MCs.Finally, a preliminary work on the bioaccessibility of total forms of MCs has been carried out. The harmonized protocol of static digestion INFOGEST has been implemented in the laboratory and tested on freshwater mussels naturally contaminated by MCs.