Etude structurale de la sporulation bactérienne et de l'enveloppe cellulaire bactérienne par cryo-microscopie électronique cellulaire

Structural study of bacterial sporulation and bacterial cell envelope by cryo cellular electron microscopy

• Auteur / Autrice : Elda Bauda
• Direction : Cécile Morlot, Christine Moriscot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 13/10/2023
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Winfried Weissenhorn
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hélène Malet, Patrick Eichenberger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Véronique Broussolle, Per Bullough

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries sporulantes

Mots clés libres

Sporulation bactérienne

Cryo microscopie electronique

Manteau de la spore

Cryo FIB SEM

Cryo ultramicrotomie

SpoIIIA-SpoIIQ

Bacterial sporulation

Cryo electron microscopy

Spore coat

Cryo FIB SEM

Cryo ultramicrotomy

SpoIIIA-SpoIIQ

Résumé

La sporulation bactérienne est un cycle de développement cellulaire qui induit la formation d’une spore, libérée dans l’environnement une fois mature. Au cours de ce processus de différentiation, une cellule mère et une préspore vont subir divers changements morphologiques et physiologiques, gouvernés des programmes d’expression génique spécifiques et compartimentalisés.Les spores bactériennes sont des cellules dormantes, insensibles aux antibiotiques et résistantes à des conditions environnementales extrêmes, notamment les détergents, les radiations et les hautes températures. Cette résilience rend les pathogènes sporulants difficiles à éliminer et contribue à leur persistance. L'incroyable résistance des spores est due à des structures moléculaires protectrices, telles que le revêtement extracellulaire multi-protéique appelé le manteau et la compaction de l'ADN au cœur de la spore.La grande majorité des sporulants appartient au groupe des bactéries Gram-positives, caractérisées par une enveloppe cellulaire composée d’une membrane cytoplasmique et d'une épaisse couche de peptidoglycane, un polymère de sucres et de peptides, qui protège et donne forme à la cellule, ainsi que d'acides teichoïques dont la fonction exacte est encore débattue. L'enveloppe bactérienne joue un rôle crucial dans de nombreux processus, tels que les interactions hôte-pathogène, la résistance à la pression osmotique et aux stress environnementaux.Malgré leur importance pour la survie de la cellule, les mécanismes impliqués dans la maturation de la spore et dans l'architecture de l'enveloppe ne sont pas totalement élucidés, principalement parce qu'ils impliquent des complexes macromoléculaires de dimensions nanométriques, dont l'assemblage nécessite l'environnement cellulaire. De ce fait, l’étude de ces processus nécessite des méthodes d'observation cellulaires à haute résolution.Pour répondre à ce défi et analyser l’ultrastructure de la préspore et de l'enveloppe cellulaire, j’ai utilisé des approches de microscopie électronique (ME) cellulaire, en particulier la section de cellules par sonde ionique focalisée combinée à la cryo-tomographie électronique cellulaire (cryo-FIBM/ET). Cette technique de pointe, qui révolutionne actuellement la compréhension des structures cellulaires, a permis d'obtenir des données structurales en trois dimensions, dans des états quasi-natifs et à haute résolution.L’étude en cryo-FIBM/ET a fourni des informations nanométriques sur l'assemblage des différentes couches du manteau et de toroïdes d'ADN dans les spores de Bacillus subtilis. Un accent particulier a été mis sur la compréhension de l'organisation structurale de SpoIVA, qui est la protéine du manteau la plus conservée parmi les sporulants, car elle sert de base pour fixer le manteau à la surface de la spore. La tomographie a également révélé des détails moléculaires de l'enveloppe cellulaire qui soutiennent l'existence d'un espace périplasmique chez les bactéries à Gram-positif. Dans ce contexte, nous avons étudié la contribution des acides teichoïques dans le maintien de cet espace chez B. subtilis et Streptococcus pneumoniae par diverses approches de ME cellulaire.En parallèle à ces études cellulaires, j’ai étudié la structure de SpoIIIAG en cryo-ME de particules isolées. SpoIIIAG forme un oligomère annulaire au sein du complexe macromoléculaire SpoIIIA-SpoIIQ. Cette nanomachine protéique, nécessaire au développement de la spore, serait un nouveau type de système de sécrétion reliant la cellule mère à la préspore. Nos données, acquises sur la forme totale membranaire de la protéine, ont révélé l’architecture et le positionnement des anneaux de SpoIIIAG à la surface de la membrane.L’ensemble de mes travaux, qui mettent en lumière des processus moléculaires essentiels au sein des cellules bactériennes, ouvrent la voie vers une meilleure compréhension des facteurs qui contribuent à la résistance des spores et à l'architecture de l'enveloppe cellulaire.

Bacterial sporulation is a cycle of cell development that leads to the formation of a spore, released into the environment once mature. During this differentiation process, a mother cell and a forespore undergo various morphological and physiological changes, governed by specific, compartmentalized gene expression programs.Bacterial spores are dormant cells, insensitive to antibiotics and resistant to extreme environmental conditions, including detergents, radiation and high temperatures. This resilience makes spore-forming pathogens difficult to eliminate and contributes to their persistence. The incredible resistance of the spores to external aggression is due to protective molecular structures, such as the multi-protein extracellular shell known as the coat and the compaction of DNA at the core of the spore.The vast majority of spore-formers are Gram-positive bacteria, whose cell envelope is composed of a cytoplasmic membrane surrounded by a thick layer of peptidoglycan, a polymer of sugars and peptides that protects and shapes the cell, as well as teichoic acids whose exact function is still debated. The bacterial envelope plays a crucial role in many processes, such as host-pathogen interactions, resistance to osmotic pressure and environmental stresses.Despite their importance for cell survival, the mechanisms involved in spore maturation and envelope architecture are not fully elucidated, mainly because they involve macromolecular complexes of nanometric dimensions, the assembly of which requires the cellular environment. As a result, the study of these processes requires high-resolution cellular observation methods.To address this challenge and analyze the ultrastructure of the forespore and cell envelope, I used cellular electron microscopy (EM) approaches, in particular cell sectioning by focused ion beam combined with cellular electron cryo-tomography (cryo-FIBM/ET). This cutting-edge technique, which is currently revolutionizing the understanding of cellular structures at the molecular level, has provided structural data in three dimensions, in quasi-native states and at high resolution.The cryo-FIBM/ET study provided nanometric information on the assembly of the different coat layers and of DNA toroids in Bacillus subtilis forespores. Particular emphasis was placed on understanding the structural organization of SpoIVA, which is the most conserved coat protein among spore-formers, as it serves as a scaffold for attaching the coat to the spore surface. Tomography also revealed molecular details of the cell envelope that support the existence of a periplasmic space in Gram-positive bacteria. In this context, we investigated the contribution of teichoic acids in maintaining this space in B. subtilis and Streptococcus pneumoniae using various cellular EM approaches.In parallel with these cellular studies, I investigated the structure of SpoIIIAG by single-particle cryo-EM. SpoIIIAG forms a ring-shaped oligomer within the macromolecular complex SpoIIIA-SpoIIQ. This proteic nanomachine, necessary for spore development, would be a new type of secretion system linking the mother cell to the forespore. Our data, acquired on the total membrane form of the protein, revealed the architecture and positioning of SpoIIIAG rings at the membrane surface.My work as a whole, which sheds light on essential molecular processes within bacterial cells, paves the way towards a better understanding of the factors contributing to spore resistance and cell envelope architecture.