Imagerie non-linéaire de l'organisation moléculaire en 3D dans les milieux biologiques

Nonlinear imaging of molecular organization in 3D in biological media

• Auteur / Autrice : Eleanor Munger
• Direction : Sophie Brasselet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique et sciences de la matière. Optique,photonique et traitement d'image
• Date : Soutenance le 14/04/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Physique et sciences de la matière (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Fresnel (Marseille, France)
• Jury : Président / Présidente : Hervé Rigneault
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sophie Brasselet, Tatiana Novikova, Jessica Ramella-Roman, Hilton Barbosa de Aguiar
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Tatiana Novikova, Jessica Ramella-Roman

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectroscopie de fluorescence

Imagerie médicale

Microscopie de polarisation

Polarisation (lumière)

Optique physique

Optique non linéaire

Mots clés libres

Imagerie

Optique non linéaire

Polarisation

Fluorescence

Microscopie

Lipide

Imaging

Nonlinear optics

Polarization

Fluroescence

Microscopy

Lipid

Résumé

La microscopie polarimétrique par fluorescence et génération de seconde harmonique est une technique utile pour obtenir des données multidimensionnelles sur des échantillons biologiques au niveau moléculaire. Pour les molécules fluorescentes liées de manière rigide à des biomolécules structurelles plus grandes, telles que les sondes lipidiques orientées et les structures fibreuses des protéines, la mesure de l'orientation de l'étiquette fluorescente peut rendre compte de la structure biologique sous-jacente. Ces marqueurs d'orientation, lorsqu'ils sont mesurés dans un ensemble localisé au foyer du microscope, ont une émission polarisée anisotrope due à leur orientation dipolaire. De même, les sous-unités protéiques répétitives dans les fibres de collagène ont un dipôle induit par deux photons (génération de seconde harmonique) sensible à l'orientation de ces sous-unités. L'absorption à deux photons pour les sondes fluorescentes permet d'améliorer la résolution axiale pour l'imagerie 3D, ainsi que de réduire la diffusion des grandes longueurs d'onde dans les tissus plus épais. Ces avantages de la microscopie à deux photons étaient intéressants pour mettre en œuvre une nouvelle méthode de détection polarisée pour mesurer l'orientation moléculaire. La plupart des techniques polarisées produisent une projection 2D de l'orientation moléculaire 3D dans l'échantillon, ce qui introduit des biais dans les lectures d'orientation résultantes. Cette thèse applique un concept de mesure de l'orientation dipolaire 3D d'une molécule unique à des mesures d'ensemble avec excitation à 2 photons dans un microscope à balayage laser. Tout d'abord, je démontre la théorie transposable d'une détection simultanée de 4 polarisations émises avec un filtrage d'intensité sur 2 de ces polarisations de la technique de molécule unique à l'ensemble à un dipôle excité par TPF ou SHG. J'examine les biais dans les différents calculs de géométrie d'illumination, ainsi que les effets du bruit de Poisson de la détection sur le calcul de l'orientation moléculaire. Ensuite, j'ai construit un microscope modulaire à 2 photons et discute des défis de l'étalonnage des composants sensibles à la polarisation à une variété de longueurs d'onde. Je démontre ensuite l'imagerie d'orientation moléculaire 3D de sondes d'orientation fluorescentes dans des membranes lipidiques dans des membranes modèles et des cellules vivantes, ainsi que liées à la F-actine dans des cellules en culture cellulaire 2D et 3D. Enfin, je montre une mesure sans marquage de l'orientation 3D des sous-unités moléculaires du collagène en utilisant l'imagerie SHG 4polaire. Les applications potentielles de cette nouvelle technique 4polaire couplée à des mesures d'ensemble multiphotoniques sont l'obtention d'informations moléculaires dans des échantillons biologiques 3D tels que la structure du collagène dans les tissus, l'hétérogénéité des membranes lipidiques dans la culture cellulaire 3D, et l'interrogation des rôles de l'actine pour les cellules interagissant avec un environnement 3D

Polarimetric fluorescence and second harmonic generation microscopy is a useful technique providing multi-dimensional data about biological samples at the molecular level. Using fluorescent tags rigidly linked to structural biomolecules such as orientational lipid probes, and protein fibre dyes, measuring the fluorescent tags' orientations can report on the underlying biological structure. These orientational tags when measured in a localized ensemble at the focus of the microscope have an anisotropic polarized emission due to their dipole orientation. Similarly, repetitive protein subunits in collagen fibres have a 2-photon induced dipole (second harmonic generation, or SHG) sensitive to the orientation of these subunits. Two-photon absorption for fluorescent probes,(TPF) allows for improved axial resolution for 3D imaging, as well as reduced scattering of longer wavelengths in thicker tissues. These 2 photon advantages to microscopy were of interest to implement a novel polarized detection method to measure molecular orientation. Most polarized microscopy results in a 2D projection of the 3D molecular orientation in the sample, introducing biases to the resulting orientation readouts. This thesis applies a concept for single molecule 3D dipole orientation measurement to ensemble measurements with 2-photon excitation in a laser scanning microscope. First, I demonstrate the translatable theory of a simultaneous detection of 4 emitted polarizations with an amplitude mask at the Fourier plane of 2 of these polarizations from single molecule technique to ensemble of TPF or SHG excited dipoles (4polar imaging). I examine the biases in different illumination geometry calculations, as well as the effects of Poisson noise from the detection on the molecular orientation calculation. Next, I constructed a modular 2-photon microscope and discuss the challenges of calibrating polarization-sensitive components at a variety of wavelengths. I then demonstrate 3D molecular orientational imaging of fluorescent orientational probes in lipid membranes in model membranes and live cells, as well as bound to F-actin in cells in 2D and 3D cell culture. Finally I show a label-free measurement of the 3D orientation of molecular subunits of collagen using SHG 4polar imaging. The prospective applications of this novel 4polar technique coupled with multi-photon ensemble measurements are for gaining molecular information in 3D biological samples such as collagen structure in tissue, lipid membrane heterogeneity in 3D cell culture, and roles of actin for cells interacting with a 3D environment