Ingénierie de métalloenzymes pour la catalyse abiologique

Metalloenzyme engineering for abiological catalysis

• Auteur / Autrice : Manon Pujol
• Direction : Ariane Jalila Simaan, Christophe Decroos
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences chimiques
• Date : Soutenance le 10/03/2023
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques (Marseille ; 1996-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences moléculaires de Marseille (ISM2)
• Jury : Président / Présidente : Valérie Belle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Lebrun
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Frédéric Avenier, Christine Cavazza

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hémoprotéines

Métalloenzymes

Biocatalyse

Chimie bioorganique

Biochimie

Mots clés libres

Chimie bioorganique

Métalloenzymes

Ingénierie des protéines

Biocatalyse

Réactions non-naturelles

Bioorganic chemistry

Metalloenzymes

Protein engineering

Biocatalysis

Non-natural reactions

Résumé

Dans un contexte de développement durable, l’industrie se tourne vers des procédés qui respectent les principes de la chimie verte (ex: remplacement des catalyseurs chimiques par des enzymes). Cependant, beaucoup de réactions industrielles n’existent pas dans la nature et plusieurs protéines héminiques ont alors été modifiées pour les catalyser. A côté, seules quelques enzymes non héminiques dépendantes du fer et une protéine à cobalt ont été décrites pour les transferts de carbènes et nitrènes alors que d'autres métaux les catalysent. Nous avons cherché à réorienter l'activité d'une classe de métalloenzymes à cuivre, les lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), afin de développer des biocatalyseurs les réactivités abiologiques. Pour cela, la sphère de coordination du cuivre de la LPMO SmAA10 a été modulée par mutagenèse pour créer de nouveaux motifs de coordination. Les mutants ont été caractérisés puis évalués sur leur capacité à catalyser des réactions non-naturelles. De bonnes activités ont été obtenues pour certaines transformations (ex : réarrangement de Doyle-Kirmse). Ces activités étant similaires à celle du cuivre en solution, nous nous sommes demandé si les réactions étaient catalysées au site actif des enzymes. En nous concentrant sur le réarrangement de Doyle-Kirmse, nous avons montré que la LPMO ne perdait pas de manière significative son cuivre. En revanche, nous mettons en évidence l’addition d’un carbène sur un résidu du site actif d'un mutant, entraînant la libération du cuivre. Nous avons ensuite étendu la gamme des réactions non naturelles catalysées par les hémoprotéines en réalisant un réarrangement de Sommelet-Hauser avec une myoglobine évoluée

In the context of sustainable development, chemical industries turn progressively towards processes respecting the criteria of green chemistry, via for example the replacement of chemical catalysts by enzymes. However, lots of industrial reactions do not exist in nature. To over come this limitation, several hemoproteins have been engineered to catalyze abiological reactions. Besides, only few non-heme iron-dependent enzymes and one cobalt protein were also reported for carbene and nitrene transfers whereas other metals catalyze them. We first aimed to repurpose the activity of a class of copper metalloenzymes, the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), to develop new biocatalysts for new-to-nature reactivities. To repurpose the LPMO activity, the copper coordination sphere within the SmAA10 LPMO was modulated by site directed mutagenesis to create new metal coordination motifs. The mutants were characterized and were then assessed for their capacity to catalyze non-natural reactions. Good activities were obtained for some abiological transformations (i.e. : the Doyle-Kirmse rearrangement). These activities being similar to that of copper in solution, we wondered if the reactions were really catalyzed at the enzyme active site. Focusing on the Doyle-Kirmse rearrangement, we found no evidence that the wild-type LPMO significantly loses some copper. In contrast, we high light the carbene addition to an active site residue to a specific LPMO mutant, resulting in its copper release. Next, we extended the non-natural reactions range catalyzed by hemoproteins by performing for a Sommelet-Hauser rearrangement with an evolved myoglobin