Conception d'une méthode de diagnostic fonctionnel des microbiotes du sol en agriculture grâce à la millifluidique de gouttes

Design of a method of functional diagnostics of soil microbiota in agriculture using droplet-based millifluidics

• Auteur / Autrice : Arthur Goldstein
• Direction : Jean Baudry, Jérôme Bibette
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Analytique
• Date : Soutenance le 24/03/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie, Biologie, Innovation (Paris) - Laboratoire de colloïdes et matériaux divisés (Paris) - Chimie innovation biologie
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Fernando Leal-Calderon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean Baudry, Jérôme Bibette, Fernando Leal-Calderon, Fabrice Martin-Laurent, Laure Vieublé Gonod
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Fabrice Martin-Laurent

Mots clés

Mots clés contrôlés

Millifluidique

Mots clés libres

Microbes du sol

Millifluidique

Solubilisation du phosphate

Agriculture

Soil microbes

Millifluidics

Phosphorus solubilisation

Agriculture

Segmented flow

Résumé

Les microbes des sols sont utiles à l’agriculture : ils aident les plantes à acquérir des nutriments, dégradent les déchets, protègent les plantations contre les pathogènes… Comprendre les interactions entre les microorganismes, les plantes et les autres éléments du sol pourrait permettre de gagner en productivité tout en préservant l’environnement. Dans cet optique, un des enjeux en agronomie est d’être capable de caractériser les communautés microbiennes des sols de manière fonctionnelle ; c’est-à-dire de quantifier les services qu’elles peuvent rendre à l’agriculture et à la société de manière générale. Par exemple, un « bon » microbiote d’un point de vue fonctionnel protégera les plantes des maladies et les aidera à acquérir des nutriments, il dégradera les éventuels polluants néfastes et limitera les efflux de gaz à effet de serre. Pour mener cette caractérisation, l’identification et l’analyse génétique des microbiotes ne suffisent pas ; des outils technologiques manquent.Nous avons choisi de nous occuper de ce problème en exploitant une technologie qui n’avait pas été employée jusqu’ici en agriculture : la millifluidique de gouttes, qui consiste à manipuler des gouttes de quelques centaines de nanolitres, séparées les unes des autres par une phase huileuse. En l’occurrence, nous avons utilisé l’automate de culture microbiologique en gouttes de la startup MilliDrop. Nous avons étudié une fonction : la capacité à solubiliser le phosphate du sol, un nutriment essentiel aux plantes. Nous avons adapté la recette d’un milieu de culture utilisé depuis plus de 70 ans : le milieu Pikovskaya. Il contient des particules de phosphate de calcium et nous avons dû mener un travail de formulation physico-chimique important pour transférer ces particules en gouttes et les y maintenir dispersées. Nous avons par ailleurs ajouté au milieu deux sondes fluorescentes qui nous ont permis de suivre à la fois le pH de nos gouttes et l’activité respiratoire. Ce protocole expérimental prêt, nous l’avons appliqué à une douzaine de sols agricoles.Grâce à la fluorescence de la résazurine, notre sonde d’activité respiratoire, nous avons estimé la concentration en cellules cultivables dans nos échantillons. Nous avons montré que l’on obtenait en tendance le même nombre de microorganismes avec notre méthode en gouttes qu’avec la méthode classique de dénombrement de colonies sur boîtes de Petri.En exploitant un bloc optique conçu pour notre projet, nous avons pu mener des mesures de néphélométrie (scattering) en gouttes et évaluer la capacité de nos microorganismes à faire baisser ce signal, ce que nous interprétons au moins partiellement comme la capacité des microorganismes à solubiliser le phosphate. Grâce à notre sonde pH, nous avons pu montrer que la baisse du signal de scattering était associée à une chute du pH sous 5,8 (qui correspond au pH théorique en-dessous duquel les particules se dissolvent par seul effet de l’acidité) dans environ 90% des gouttes. Il est possible que parmi les 10% des gouttes restantes, on trouve des microorganismes qui sécrètent de grandes quantités de chélatants, ce qui représente un intérêt agricole particulier. On trouve systématiquement plus de microorganismes solubilisateurs en gouttes qu’avec la méthode traditionnelle sur boîte de Petri, sans pour autant avoir de corrélation entre ces deux modes de mesure. Si différentes hypothèses pourraient être testées pour éclaircir ce phénomène, nos résultats remettent en question le test traditionnel sur boîtes.Notre protocole est rapide et simple : nos expériences ont pu être réalisées par une technicienne non spécialisée, le traitement de données est automatisable et une demi-heure de travail suffit à analyser quatre sols (plus avec de prochaines versions de la machine). Les résultats en gouttes sont obtenus sept fois plus vite que ceux sur boîtes de Petri. Cela fait de notre protocole un candidat pour devenir un test fonctionnel utilisé à grande échelle.

Soil microbes are useful in agriculture: they help plants to acquire nutrients, degrade waste, protect crops against pathogens, etc. Understanding the interactions between microorganisms, plants and other soil elements could help increase productivity while preserving the environment. From this perspective, one of the challenges in agronomy is to be able to characterize soil microbial communities in a functional manner; that is, to quantify the services they can render to agriculture and society in general. For example, a "good" microbiota from a functional point of view will protect plants from diseases and help them acquire nutrients, degrade harmful pollutants and limit the influx of greenhouse gases. To carry out this characterization, the identification and genetic analysis of microbiotes is not sufficient; technological tools are lacking.We chose to address this problem by exploiting a technology that has not been used in agriculture until now: droplets millifluidics, which consists in manipulating drops of a few hundred nanoliters, separated from each other by an oily phase. In this case, we used the automated microbiological drop culture system from MilliDrop, a startup from our lab. We studied one function: the ability to solubilize soil phosphate, an essential plant nutrient. We adapted the recipe of a culture medium used for more than 70 years: Pikovskaya medium. It contains particles of calcium phosphate and we had to carry out an important physicochemical formulation work to transfer these particles into drops and keep them dispersed. We also added two fluorescent probes to the medium that allowed us to monitor both the pH of our drops and the respiratory activity. Once the experimental protocol was ready, we applied it to a dozen agricultural soils.Thanks to the fluorescence of resazurin, our respiratory activity probe, we estimated the concentration of cultivable cells in our samples. We showed that the same number of microorganisms was obtained in trend with our drop method as with the classical method of counting colonies on Petri dishes.By using an optical block designed for our project, we have been able to conduct optical scattering measurements in drops and evaluate the ability of our microorganisms to lower this signal, which we interpret at least partially as the ability of the microorganisms to solubilize phosphate. Thanks to our pH probe, we were able to show that the fall of the scattering signal was associated with a pH fall below 5.8 (which corresponds to the theoretical pH below which particles dissolve by the sole effect of acidity) in about 90% of the drops. It is possible that among the remaining 10% of the drops there are microorganisms that secrete large quantities of chelating agents, which is of particular agricultural interest. There are systematically more solubilizing microorganisms in the drops than with the traditional Petri dish method, but there is no correlation between these two methods of measurement. While different hypotheses could be tested to clarify this phenomenon, our results call into question the traditional test on plates.Our protocol is quick and simple: our experiments were carried out by a non-specialized technician; data processing can be automated, and half an hour of work is enough to analyze four soils (more with future versions of the machine). The results in drops are obtained seven times faster than those on Petri dishes. This makes our protocol a candidate to become a functional test used on a large scale.