Développement de nouvelles approches analytiques pour le criblage de peptides chélateurs de fer

Development of new analytical methods for the screening of iron-chelating peptides

• Auteur / Autrice : Cédric Paris
• Direction : Stéphane Desobry, Laetitia Canabady-Rochelle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie Biotechnologique et Alimentaire
• Date : Soutenance le 20/04/2021
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale SIReNa - Science et ingénierie des ressources naturelles (Lorraine ; 2018-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'ingénierie des biomolécules (Vandoeuvre-les-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Patrick Chaimbault
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Desobry, Laetitia Canabady-Rochelle, Emilie Destandau, Peter Faller, Katalin Selmeczi, Thierry Maugard, Loïc Quinton
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emilie Destandau, Peter Faller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines -- Analyse

Criblage pharmacologique

Fer -- Composés

Chélates

Mots clés libres

Peptides chélateurs de fer

Criblage direct

Méthode LC-MS en ligne

Chromatographie d'affinité pour métal immobilisé (IMAC)

Analyse différentielle de spectres de masse

Hydrolysats protéiques

Iron-chelating peptides

Direct screening

Online LC-MS method

Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC)

Differential analysis of mass spectra

Protein hydrolysates

Résumé

Face au besoin croissant de nouvelles molécules bioactives d’origine naturelle, les coproduits de l’industrie alimentaire et de transformation d’agroressources constituent une ressource stratégique à exploiter. En effet, l’hydrolyse enzymatique de protéines végétales ou animales permet de générer une grande variété de séquences peptidiques avec des propriétés biologiques potentielles : antihypertensive, antithrombotique, anticancéreuse, opioïde, antimicrobienne. Malgré le potentiel bioactif de certains peptides, leur présence incertaine et leur faible concentration au sein d’un hydrolysat protéique (mélange complexe constitué d’une dizaine à parfois plus d’une centaine de peptides) limitent leur purification et leur exploitation. Aussi, les peptides bioactifs pourraient être criblés préalablement à toute phase séparative afin de n’engager l’étape de séparation qu’en cas d’activité avérée. Le pouvoir antioxydant est un terme générique qui regroupe divers mécanismes chimiques tels que l’activité anti-radicalaire, l’inhibition de la peroxydation des lipides, ou encore la chélation de métaux. En chélatant les métaux de transition naturellement présents in vivo (fer, cuivre), les peptides chélateurs pourraient être utilisés comme antioxydants indirects et agir ainsi contre le stress oxydant. L’objectif principal de cette thèse est de développer des méthodes originales de criblage à haut débit des peptides chélateurs de fer présents dans des hydrolysats peptidiques. A terme, ces méthodes pourraient être appliquées à tous types de mélanges peptidiques complexes. La première approche développée met en œuvre la chromatographie d'affinité pour ions métalliques immobilisés (IMAC). Cette technique est incontournable pour purifier des peptides chélateurs de métaux au sein des hydrolysats. Grâce à la spécificité d’interaction entre un métal donné – immobilisé sur la phase stationnaire IMAC – et des motifs complexants déterminés, il est possible d’identifier sélectivement les composés chélateurs présents dans des mélanges complexes. Notre objectif étant de parvenir à une détection rapide de ces molécules d’intérêt, nous avons réalisé un couplage en ligne avec la spectrométrie de masse (MS). La deuxième stratégie consiste à évaluer la formation des complexes fer-peptide en solution. Dans ce cas, tous les sites accepteurs d’électrons du métal sont accessibles (au contraire de la technique IMAC qui présente un biais potentiel de ce point de vue) et, d’autre part, les conditions de solubilisation peuvent simuler le milieu visé (i.e. le milieu intracellulaire). Par ailleurs, l’observation de la forme complexée avec le fer (FeII ou FeIII) fournit une preuve directe et irréfutable de la capacité de chélation d’un peptide. Ainsi, la mise en évidence d’un peptide chélateur peut être réalisée par détection concomitante de sa forme libre (peptide seul) et de sa forme complexée (fer-peptide). Dans cette approche, la spectrométrie de masse – de par sa sensibilité et sa spécificité – est une technique de choix pour réaliser le criblage souhaité. Après avoir été testés sur des peptides des synthèse (sous forme pure et en mélange), les deux protocoles ont été appliqués à un hydrolysat protéique réel. Les résultats préliminaires obtenus sont prometteurs et permettent d'envisager, à court terme, le criblage automatisé de divers hydrolysats réels, pour la recherche de peptides chélateurs du fer(II) et du fer(III).

Faced with the growing need for new bioactive compounds of natural origin, by-products from the agro-food industry and the processing of agro-resources constitute a strategic resource to be exploited. In fact, the enzymatic hydrolysis of plant or animal proteins makes it possible to generate a wide variety of peptide sequences with potential biological properties: antihypertensive, antithrombotic, anticancer, opioid, antimicrobial. Despite the bioactive potential of certain peptides, their uncertain presence and their low concentration in a protein hydrolysate (a complex mixture sometimes made up of more than a hundred peptides) limit their purification and use. Also, bioactive peptides could be screened before their purification in order to initiate the separation step only if activity is proven. Antioxidant power is a generic term which groups together various chemical mechanisms such as anti-free radical activity, inhibition of lipid peroxidation, or even metal chelation. By chelating the transition metals naturally present in vivo (iron, copper), the chelating peptides could be used as indirect antioxidants and thus act against oxidative stress. The main objective of this PhD thesis is to develop original methods for high throughput screening of iron-chelating peptides present in protein hydrolysates. Ultimately, these methods could be applied to all types of complex peptide mixtures. The first approach is based on immobilized metal affinity chromatography (IMAC). IMAC is a reference technique for purifying metal-chelating peptides in hydrolysates. Thanks to the specificity of interaction between a given metal – immobilized on the stationary phase IMAC – and determined complexing groups, it is possible to selectively identify the chelators present in complex mixtures. Our objective being to achieve a rapid detection of these molecules of interest, we carried out an on-line coupling with mass spectrometry (MS). The second strategy consists of evaluating the formation of iron-peptide complexes in solution. In this case, all the electron acceptor sites of the metal are accessible (unlike the IMAC technique which presents a potential bias from this point of view) and, on the other hand, the solubilization conditions can simulate the target medium (i.e. the intracellular medium). In addition, the observation of the peptidic form complexed with iron (FeII or FeIII) provides direct and irrefutable proof of the chelating capacity of a peptide. Thus, the identification of a chelating peptide can be carried out by the concomitant detection of its free form (peptide) and of its complexed form (iron-peptide). In this approach, mass spectrometry – thanks to its sensitivity and its specificity - is a technique of choice for carrying out the desired screening. After having been tested on synthetic peptides (pure solutions and mixture), the two protocols were applied to a real protein hydrolysate. The preliminary results are promising and make it possible to envisage, in the short term, the automated screening of various real hydrolysates for the search for iron(II)- and iron(III)-chelating peptides.