Évaluation de l'activité d'une LPMO AA9 modulaire sur des substrats cellulosiques

Assessing the activity of a modular AA9 LPMO on cellulosic substrates

• Auteur / Autrice : Amani Chalak
• Direction : Bernard Cathala, Jean-Guy Berrin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie, biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 07/02/2020
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Écologie Géosciences Agronomie Alimentation (Rennes ; 2016-2022)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biopolymères, Interactions, Assemblages BIA (Unité de recherche INRA - Université de Nantes)
• Jury : Président / Présidente : Charles Tellier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gabrièle Véronèse, Evangelos Topakas, Caroline Rémond
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Gabrièle Véronèse, Evangelos Topakas

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biocarburants

Nanocellulose

Sordariales

Mots clés libres

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Résumé

Les « lytic polysaccharides monooxygenases »(LPMO), sécrétées par les champignons filamenteux, jouent un rôle important dans la dégradation de la biomasse lignocellulosique récalcitrante. Ils peuvent se présenter sous la forme de protéines multidomaines fusionnées à un « Carbohydrate Binding Module » (CBM). Sur le plan biotechnologique, les LPMOs sont des outils prometteurs et innovants pour la production de nanocelluloses et de biocarburants, mais leur action directe sur les substrats cellulosiques n’est pas pleinement comprise. Résultats: Nous avons étudié l'action d’un module de liaison à la cellulose (CBM1) lié à la LPMO9H de Podospora anserina (PaLPMO9H) en utilisant des substrats cellulosiques modèles. La suppression du CBM1 a affaibli la liaison à la cellulose nanofibrillée, à la cellulose amorphe et cristalline. Bien que la libération de sucres solubles ait été considérablement réduite dans des conditions normales, la LPMO tronquée a conservé une certaine activité sur les oligosaccharides solubles. L'action cellulolytique de la LPMO tronquée a été démontrée à l'aide d'expériences de synergie avec une cellobiohydrolase (CBH). En effet, la LPMO tronquée était encore capable d’améliorer l’action du CBH sur la cellulose. L'analyse de la fraction insoluble a confirmé que le module CBM1 n'était pas strictement nécessaire pour favoriser la perturbation du réseau de cellulose. Sur la base de ces résultats, nous avons réduit la quantité d'eau dans la réaction pour augmenter la probabilité d'interaction enzymesubstrat dans un contexte sans CBM. Ces conditions ont amélioré les performances de PaLPMO9H sans CBM en termes de libération de produits. Il est intéressant de noter que l’élimination du CBM a modifié la régiosélectivité de PaLPMO9H avec une libération importante de produits oxydés en C1. Ces résultats fournissent des informations sur le mécanisme d’action des LPMO fongiques sur la cellulose pour produire des nanocelluloses et des biocarburants.

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) secreted by filamentous fungi play a key role in the degradation of recalcitrant lignocellulosic biomass. They can occur as multidomain proteins fused to a carbohydrate-binding module (CBM). On a biotechnological point of view, LPMOs are promising and innovative tools for the production of nanocelluloses and biofuels but their direct action on cellulosic substrates is not fully understood. Results: We probed the action of the family 1 CBM (CBM1) appended to the LPMO9H from Podospora anserina (PaLPMO9H) using model cellulosic substrates. As expected, the deletion of the CBM1 weakened the binding to nanofibrillated, amorphous and crystalline cellulose. Although the release of soluble sugars from cellulose was drastically reduced under standard conditions, the truncated LPMO retained activity on soluble oligosaccharides. The cellulolytic action of the truncated LPMO was demonstrated by synergy experiments with a cellobiohydrolase (CBH). The truncated LPMO was still able to improve the efficiency of the CBH on cellulose nanofibrils similarly to the full length LPMO. Analysis of the insoluble fraction of cellulosic substrates confirmed that the CBM1 module was not strictly required to promote the disruption of the cellulose network. Based on these results we reduced the amount of water to increase the probability of enzymesubstrate interaction in a CBM-free context. These conditions enhanced the performance of PaLPMO9H without CBM in terms of products release. Interestingly, removing the CBM altered the regioselectivity of PaLPMO9H increasing C1 oxidized products. These results provide insights into the mechanism of action of fungal LPMOs on cellulose to produce nanocelluloses and biofuels.