Régulation et rôle de la compaction de la chromatine dans des cellules pluripotentes et lors de la différentiation

Regulation and role of chromatin compaction in pluripotency and during differentiation

• Auteur / Autrice : Claire Dupont
• Direction : Robert Feil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 09/12/2020
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Bantignies
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Robert Feil, Frédéric Bantignies, Slimane Ait-Si-Ali, Kerstin Bystricky, Francesca Palladino, David Lleres
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Slimane Ait-Si-Ali, Kerstin Bystricky

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Génomique

Chromatine

Mots clés libres

Chromatine

Flim-Fret

Compaction

Conformation spatiale

Chromatin

Flim-Fret

Compaction

Spatial conformation

Résumé

Régulation et rôle de la compaction de la chromatine dans des cellules pluripotentes et lors de la différenciation. La structuration de la chromatine est essentielle pour diverses fonctions génomiques et cellulaires, notamment la transcription, la réparation de l'ADN ou la survie des cellules. Les cellules pluripotentes peuvent être dérivées en cellules des trois feuillets embryonnaires mais présentent également une capacité d'auto-renouvellement. En comparaison avec les cellules somatiques, la chromatine des cellules pluripotentes a été caractérisée comme ouverte, transcriptionnellement active et accessible. Bien que les approches microscopiques et 3C actuelles génèrent une résolution spatiale ≤50nm et des cartes d'interactions à haute résolution, elles sont réalisées sur des populations cellulaires, impliquent des réactions de « cross-linking », la fixation cellulaire ou l'utilisation d’un nombre limité de sondes contre des loci génétiques. Pour contourner ces limites, nous avons directement quantifié et cartographié la structuration de la chromatine à l'échelle nanométrique dans des cellules souches embryonnaires vivantes par l’utilisation de la technique de FRET basée sur la technique de FLIM. Quelle est la structuration de la chromatine à l’échelle nanométrique dans des cellules souches embryonnaires vivantes ? Comment est organisée l’hétérochromatine constitutive à l’échelle nanométrique in vivo? Mon projet de thèse a pour but de répondre à ces questions. Afin de mesurer la structuration de la chromatine par l’approche de FRET, j'ai généré des cellules souches embryonnaires primaires (ESCs) exprimant de manière stable les histones H2B fusionnées à la GFP ou mCherry. Mes mesures de FRET ont montré que la chromatine présente différents degrés de structuration à l'échelle nanométrique dans les ESCs vivantes. Etonnamment, les régions denses en nucléosomes communément associées à l’hétérochromatine constitutive présentent les plus faibles niveaux de nanocompaction. De manière intéressante, mes résultats montrent que la protéine HP1α joue un rôle important dans la désorganisation de l’hétérochromatine des ESCs vivantes en diminuant la proximité entre les nucléosomes. Au contraire, la marque répressive H4K20me3 semble essentielle à la conservation d’un certain degré de structuration en maintenant les contacts entre nucléosomes. De plus, mes données ont démontré la présence d’une structure plus nanocompactée à la périphérie du noyau, régulée en partie par la déposition de H3K9me2 par le complexe G9a/GLP.

Regulation and role of chromatin compaction in pluripotent cells and during differentiation.The structuration of chromatin in the nucleus is essential for diverse genomic functions including transcription, DNA repair, cell survival and proper development. Pluripotent ES cells can be derived into cells from the three embryonic layers but also present a self-renewal capacity. In comparison with somatic cells, chromatin of ES cells has been described as open, transcriptionally active and accessible. But why do pluripotent cellsAlthough current microscopic and 3C-based approaches generate a spatial resolution of ≤50nm and high-resolution interaction maps, they are performed on cell populations, involve cross-linking, cell fixation, or the use of probes limited to a small number of genetic loci.To circumvent these limitations, we quantified and mapped nanoscale chromatin compaction in living ESCs by using the FLIM-based FRET technique.What is the nanoscale chromatin structuring in living embryonic stem cells? How is constitutive heterochromatin organized at the nanoscale in vivo?My thesis project aims at answering these questions. In order to measure the chromatin structuration by the FRET approach, I generated primary embryonic stem cells (ESCs) that stably express histone H2B fused to EGFP and H2B fused to mCherry proteins. My FRET measurements showed that chromatin has different degrees of nanoscale structuration in living ESCs. Surprisingly, the nucleosome-dense regions commonly associated with constitutive heterochromatin exhibit the lowest levels of nanocompaction. Interestingly, my results show that the protein HP1α plays an important role in the heterochromatin disorganization of living ESCs by decreasing the proximity between nucleosomes. On the contrary, the repressive mark H4K20me3 seems to be essential for the preservation of a certain degree of structuring by maintaining contacts between nucleosomes. In addition, my data demonstrated the presence of a more nanocompacted structure at the periphery of the nucleus, regulated in part by the deposition of H3K9me2 by the G9a/GLP complex.