Distribution temporelle d’Etats Physiologiques au sein de Culture Pure Bactérienne Productrice d’Isopropanol : Prise en compte des sous-populations microbiennes pour une optimisation du procédé

Temporal distribution of physiological states within pure bacterial cultures producing isopropanol : understanding of microbial subpopulation to process optimization

• Auteur / Autrice : Catherine Boy
• Direction : Stéphane Guillouet, Nathalie Gorret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 18/12/2020
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Marielle Bouix
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Guillouet, Nathalie Gorret, Catherine BéAL, Stéphane Delaunay, Sandrine Alfenore, Jillian Marc
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Catherine BéAL, Stéphane Delaunay

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Isopropanol

Mots clés libres

Hétérogénéité de population

Bioréacteur

Cupriavidus necator

Isopropanol

Egfp

Cytométrie en flux

Population heterogeneity

Bioreactor

Cupriavidus necator

Isopropanol

Egfp

Flow cytometry

Résumé

Les cultures monoclonales de microorganismes en bioréacteur ont longtemps été considérées comme homogènes (i.e. toutes les cellules sont identiques). Cependant, des hétérogénéités de population peuvent survenir, dues à des modifications stochastiques de l’expression génétique, une instabilité plasmidique ou à des gradients de concentration. Cette hétérogénéité peut impacter négativement les performances des procédés en diminuant leur robustesse, notamment dans le cas de production de molécules recombinantes. L’objectif de ce travail est d’identifier les sous-populations provenant d’une culture pure en bioréacteur, de comprendre leurs effecteurs et de contrôler leur distribution. Le modèle d’étude choisi est la production d’isopropanol par une souche recombinante de Cupriavidus necator. Des outils doivent être développés pour suivre le comportement de ces sous-populations en cours de fermentation. Néanmoins, de tels outils ne sont, à ce jour, pas encore adaptés au suivi dynamique des cultures bactériennes. Ainsi pour répondre aux questions scientifiques, un biosenseur eGFP (codé sur un plasmide recombinant chez C. necator) a été construit afin de suivre dynamiquement des sous-populations par cytométrie en flux en cours de cultures en bioréacteurs. Différentes stratégies de stabilisation plasmidique, dans différentes conditions d’environnements contrôlées, ont été étudiées afin de caractériser leur réponse et efficacité. Deux méthodes différentes mais complémentaires pour le suivi de stabilité de l’expression plasmidique ont été mises en place : la numération sur boîte et la cytométrie en flux. Dans un premier temps, la production d’isopropanol par C. necator en culture discontinue alimentée a été étudiée avec différentes constructions plasmidiques. Les rendements et vitesses de production en isopropanol diminuent drastiquement lorsque l’instabilité de l’expression plasmidique augmente. Ce seuil peut être modulé en fonction du design plasmidique (système de stabilisation plasmidique ou non). Dans un second temps, une technique de suivi de l’expression plasmidique à l’échelle de la cellule unique a été développée. Le gène codant pour l’eGFP a été inséré sur le plasmide recombinant. L’impact de la force de différents promoteurs constitutifs a été quantifié afin de déterminer la construction présentant la charge métabolique la plus faible sur les cellules hôtes tout en garantissant une sensibilité satisfaisante des mesures de fluorescence. L’outil ainsi défini a ensuite été confronté à des conditions de cultures permettant de générer une hétérogénéité de population, afin de comprendre ses réponses en fonction des conditions opératoires. Ainsi, l’impact du taux de croissance sur le niveau d’expression plasmidique a pu être étudié en culture continue, dans des conditions stringentes de perte plasmidique. De plus, la robustesse de souches non productrices d’isopropanol, a été évaluée dans différentes conditions d’alimentation en substrat et de systèmes de stabilisation plasmidique. Dans un dernier temps, le système de suivi de l’expression plasmidique a été inséré dans un plasmide codant pour la production d’isopropanol. Son insertion a conduit à une diminution de la productivité en isopropanol, liée à une instabilité d’expression plasmidique par rapport à la souche non fluorescente. Des niveaux différents d’expression plasmidique ont pu être identifiés et quantifiés en cours de culture. Ces travaux ont permis, de par le développement d’un biosenseur, de mieux comprendre le lien entre les conditions opératoires imposées au cours des cultures bactériennes et l’apparition d’hétérogénéité de l’expression plasmidique sur la robustesse d’un procédé.

Monoclonal cultures of microorganisms in bioreactors have long been considered homogeneous (i.e. all cells are identical). However, population heterogeneities may occur, due to stochastic changes in gene expression, plasmid instability or concentration gradients. This heterogeneity can negatively impact the performance of the processes by decreasing their robustness, especially in the case of recombinant molecule production. The objective of this work is to identify the sub-populations coming from a pure culture bioreactor, to understand their effectors and to control their distribution. The chosen study model is the production of isopropanol by a recombinant strain of Cupriavidus necator. Tools need to be developed to monitor the behavior of these sub-populations during culture. However, such tools are not yet adapted to the dynamic monitoring of bacterial cultures. Thus, to answer the scientific questions, an eGFP biosensor (coded on a recombinant plasmid in C. necator) has been built to dynamically monitor sub-populations by flow cytometry during bioreactor cultures. Different plasmid stabilization strategies, under different controlled environment conditions, were studied in order to characterize their response and efficacy. Two different but complementary methods for monitoring the stability of plasmid expression have been implemented: plate count and flow cytometry. In a first step, isopropanol production by C. necator in fed batch culture was studied with different plasmid constructs. Isopropanol yields and production rates decreased drastically as the instability of plasmid expression increased. This threshold can be modulated according to the plasmid design (plasmid stabilization system or not). In a second step, a technique for plasmid expression monitoring at the single-cell level has been developed. The gene coding for eGFP was inserted into the recombinant plasmid. The impact of the strength of different constitutive promoters was quantified in order to determine the construct with the lowest metabolic load on host cells while ensuring satisfactory sensitivity of the fluorescence measurements. The tool defined was then confronted with culture conditions allowing the generation of population heterogeneity, in order to understand its responses according to the operating conditions. Thus, the impact of growth rate on plasmid expression level was studied in continuous culture, under stringent conditions of plasmid loss. In addition, the robustness of non-isopropanol-producing strains was evaluated under different conditions of substrate feeding and plasmid stabilization systems. Finally, the plasmid expression monitoring system was inserted into a plasmid coding for isopropanol production. Its insertion led to a decrease in isopropanol productivity, linked to instability of plasmid expression compared to the non-fluorescent strain. Different levels of plasmid expression could be identified and quantified during culture. This work has allowed, through the development of a biosensor, to better understand the link between the operating conditions imposed during bacterial cultures and the appearance of plasmid expression heterogeneity on the robustness of a process.