Thèse soutenue

Biosynthèse de nouveaux dérivés de l'alpha-bisabolol par une approche de biologie synthèse
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Auteur / Autrice : Arthur Sarrade-Loucheur
Direction : Gilles TruanMagali Remaud
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
Date : Soutenance le 30/06/2020
Etablissement(s) : Toulouse, INSA
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
Jury : Président / Présidente : Fayza Daboussi
Examinateurs / Examinatrices : Gilles Truan, Magali Remaud, Fayza Daboussi, Véronique de Berardinis, Jean-Etienne Bassard, Danièle Werck-Reichhart
Rapporteurs / Rapporteuses : Véronique de Berardinis, Jean-Etienne Bassard

Résumé

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La biologie de synthèse permet désormais la production de nouvelles molécules n’existant pas dans la nature. Au cours de cette thèse, nous nous sommes focalisés sur la diversification de produits issus du (+)-epi-α-bisabolol. Cette molécule issue de la plante Lippia dulcis appartient à la vaste famille des sesquiterpènes qui recèle de nombreuses activités biologiques. En particulier, le (+)-epi-α-bisabolol est le précurseur de l’hernandulcine, un édulcorant intense. Cependant, la dernière étape d’oxydation conduisant à ce composé demeure inconnue.Plutôt que de rechercher la (ou les enzymes) intervenant dans la voie de biosynthèse de l’hernandulcine chez L. dulcis, nous avons choisi de mettre à profit la promiscuité connue de cytochromes P450 pour diversifier les molécules issues du (+)-epi-α-bisabolol ou de reproduire la voie de synthèse naturelle. Tout d’abord, une souche châssis adaptée au criblage in vivo a été construite en exprimant la (+)-epi-α-bisabolol synthase (BBS) et une NADPH cytochrome P450 réductase. Puis, le criblage in vivo chez la levure a montré que des cytochromes P450 (CYPs) parmi notre banque de 25 enzymes impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques (CYPs animaux) oxydaient le (+)-epi-α-bisabolol. Parmi ces produits, le 14-hydroxy-(+)-epi-α-bisabolol a été purifié et caractérisé par RMN tandis que la structure probable d’un second produit a été obtenue (9-hydroxy-(+)-epi-α-bisabolol). En parallèle, la production de produits hydroxylés (+)-epi-α-bisabolol a été optimisée notamment par l’addition d’une copie génomique supplémentaire de BBS, avec un titre de de produit hydroxylé de 64 mg/L. Ainsi, nous avons démontré le potentiel des CYPs du métabolisme des xénobiotiques dans la synthèse de nouvelles molécules issues des sesquiterpènes.Parmi les enzymes identifiées, deux enzymes homologues, CYP2B6 et CYP2B11 ont catalysé la formation de produits différents à partir du (-)-α-bisabolol et du trans,trans-farnésol. Pour identifier les possibles déterminants moléculaires responsables de la spécificité de chacune de ces deux enzymes, des chimères échangeant divers éléments de structure secondaire de CYP2B6 dans CYP2B11 ont été comparées. Ainsi, la spécificité ne peut pas être expliquée par un seul élément de la structure secondaire mais plus probablement par des déterminants disséminés en divers endroits des séquences protéiques des deux enzymes.Afin d’étendre la diversité de molécules produites à partir de l’α-bisabolol et de l’hernandulcine et de produire des composés aux propriétés physico-chimiques améliorées (solubilité, pouvoir sucrant…) des essais de glycosylation par une glucosyltransférase de plante (UGT93B16) et par des glucuronosyltransférases humaines ont été menés. UGT93B16 a démontré son potentiel en glucosylant l’α-bisabolol et l’hernandulcine. La bioconversion de ces molécules en utilisant E. coli and S. cerevisiae a également montré une meilleure conversion chez la levure. Concernant les UDP-glucuronosyltransférases, des essais enzymatiques ont mis en évidence une activité d’UGT1A9, d’UGT2B4 et d’UGT2B7 pour l’α-bisabolol et l’hernandulcine. Toutefois, l’introduction de ces enzymes dans la levure n’a pas été permis la production de sesquiterpènes glucuronylés à un niveau détectable. Pour résumer, nous avons prouvé la faisabilité de la production de nouveaux sesquiterpènes glycosylés soit par voie enzymatique soit par bioconversion chez deux microorganismes couramment utilisés en biotechnologie.En conclusion, les approches utilisées au cours de cette thèse ont montré l’intérêt du criblage d’enzymes promiscuitaires pour l’α-bisabolol et la production de nouvelles molécules. Nous avons exploré les limites de notre souche châssis et une régulation plus fine du métabolisme de S. cerevisiae pourrait améliorer les titres obtenus. Enfin, le couplage des étapes impliquant un cytochrome P450 et une glucosyltransférase est désormais envisageable afin de créer une voie encore plus orthogonale.