Protéines avec un domaine de type RBM impliquées dans la sporulation bactérienne

Proteins with RBM(ring-building motif)-like domain involved in bactaria sporulation

• Auteur / Autrice : Bowen Liu
• Direction : Cécile Morlot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 09/11/2020
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Breyton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cécile Morlot, Stéphanie Ravaud, Juan-Carlos Fontecilla-Camps, Simonetta Gribaldo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Véronique Broussolle, Romé Voulhoux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sécrétion -- Régulation

Bactéries sporulantes

Mots clés libres

Sporulation

Sécrétion

Complexe SpoIIIA-SpoIIQ

Les motifs de construction d'anneaux

YhcN

Sporulation

Secretion

SpoIIIA-SpoIIQ complex

Ring-Building motif

YhcN

Résumé

Les systèmes de sécrétion spécialisés des bactéries Gram-négatives permettent le transport de molécules à travers leur enveloppe cellulaire à double membrane. Les systèmes de sécrétion de type II et III comprennent des protéines qui forment de larges anneaux oligomériques. Il s’agit des protéines de la famille de PrgK/PrgH dans les systèmes de sécrétion de type III, et des familles de sécrétines de type InvG/GspD dans les systèmes de sécrétion de type III/II. Ces protéines possèdent des domaines RBM ("Ring-Building Motif") qui sont composés d'un feuillet β à trois brins accolé à deux hélices α et sont impliqués dans la formation des anneaux oligomériques.Lors de la sporulation chez B. subtilis, la préspore se retrouve entourée d’une double membrane, suite à son endocytose par la cellule mère. A cette étape, la poursuite du développement de la préspore nécessite l’assemblage d’un grand complexe membranaire multiprotéique appelé le complexe SpoIIIA-SpoIIQ. D’étonnantes similitudes structurales ont été observées entre ses composants et des constituants essentiels des systèmes de sécrétion spécialisés. En particulier, certaines des protéines SpoIIIA-SpoIIQ possèdent des domaines de type RBM (AF, AG, AH et GerM). Parmi eux, AG forme de larges anneaux oligomériques qui présentent des similarités et des différences remarquables avec les anneaux de PrgK et PrgH. La formation d'anneaux par AG suggère que le complexe SpoIIIA-SpoIIQ pourrait servir de machinerie de sécrétion entre la cellule mère et la préspore. A ce jour, AG est le seul composant du complexe dont la capacité à former des anneaux oligomériques a été montrée.Les domaines de type RBM chez les protéines SpoIIIA-SpoIIQ contiennent un cœur RBM similaire à ceux trouvés chez PrgK et PrgH, ainsi que des structures secondaires additionnelles (brins β ou hélices α). Le rôle de ces structures secondaires dans la formation d’anneaux reste non élucidé et il est possible que certaines d’entre elles promeuvent ou inhibent l’oligomérisation de la protéine. Afin d’étudier cette question, j’ai produit, purifié et caractérisé des formes recombinantes solubles tronquées, ainsi que des formes membranaires complètes de AG, AH et AF.Ce travail a montré que le cœur du domaine RBM de AG n'est pas suffisant pour promouvoir son oligomérisation in vitro. Cette dernière requiert la présence d’une région d’insertion qui forme un tonneau β. J’ai par ailleurs montré que la délétion de l’hélice α supplémentaire chez AH n’induit pas l’oligomérisation de la protéine. La présence des segments transmembranaires n’a pas non plus permis d’obtenir des anneaux oligomériques in vitro. La forme complète membranaire de AG solubilisée à l’aide d’un détergent a formé un double anneau. Bien que leur pertinence physiologique reste à démontrer, la résolution de la structure de ces doubles anneaux, permettra d’obtenir des informations manquantes concernant la structure de AG.Des domaines de type RBM ont également été prédits d’autres protéines de la sporulation. Cette observation souleve l'hypothèse que d'autres systèmes de sécrétion putatifs pourraient se former au cours du processus de sporulation. J'ai produit et purifiée une forme recombinante soluble de l'une de ces protéines, appelée YhcN et impliquée dans la germination des spores. J’ai cristallisé YhcN et résolu sa structure cristallographique, qui a révélé la présence d'un cœur RBM associé à deux hélices α C-terminales supplémentaires. Aucun assemblage de haut degré oligomérique n’a pu être détectée dans le cristal ou en solution pour YhcN.Dans l'ensemble, mes travaux remettent en question la fonction de formation d'anneaux qui a été attribuée aux domaines RBM et suggèrent que certains de ces domaines pourraient avoir évolué pour accomplir des rôles différents. Certains de ces domaines pourraient par exemple avoir perdu leur capacité d’homo-oligomérisation au profit d’interactions avec d’autres partenaires protéiques.

Specialized secretion systems found in Gram-negative bacteria allow the transport of molecules across their double-membrane cell envelope. Components of these nanomachines include ring-forming proteins from the PrgK and PrgH families, which are part of the inner membrane platform in Type-III secretion systems, or the InvG and GspD secretins from Type-III and Type-II secretion systems, respectively. Homo-oligomerization of these proteins involves a domain called RBM for "Ring-Building Motif". Despite low sequence identity, RBM domains display a conserved wedge-shaped fold composed of a three-stranded β-sheet packed against two α-helices.Because the cell envelope of Gram-positive bacteria possess a single membrane, double-membrane spanning machineries are not necessary for secretion. During spore formation in Gram-positive bacteria however, the mother cell engulfs the developing spore, encasing it with a double membrane. Communication between the two cells involves a large multi-protein complex called the SpoIIIA-SpoIIQ complex. The global architecture and function of this new machinery remains mysterious but its components display structural similarities with essential constituents of specialized secretion systems. In particular, some of the SpoIIIA-SpoIIQ proteins possess RBM-like domains and one of them, called SpoIIIAG, forms large oligomeric rings that display remarkable similarities and differences with PrgK and PrgH rings from Type-III secretion systems. Ring formation by SpoIIIAG provides evidence that the SpoIIIA-SpoIIQ complex might serve as a secretion machinery between the mother cell and forespore but assembly of a trans-envelope channel requires oligomerization of other SpoIIIA-SpoIIQ proteins.To get further insights into the capacity of RBM-containing SpoIIIA-SpoIIQ proteins to form rings, I produced, purified and characterized full-length membrane and truncated soluble forms of these proteins. This part of my work showed that the RBM domain alone in SpoIIIAG is not sufficient to promote oligomerization in vitro, and that additional secondary structures observed in non-canonical RBM domain is not what prevents them from forming rings in vitro.Intriguingly, RBM domains were also found in proteins that are not related to the SpoIIIA-SpoIIQ complex and raised the hypothesis that other putative secretion systems might form during sporulation. In order to investigate this, I studied the structure and oligomerization ability of one of these proteins, which is called YhcN and is likely involved in spore germination. The crystallographic structure of YhcN revealed the presence of a non-canonical RBM domain and the protein did not show any oligomerization ability.Altogether, my work questions the ring-forming function associated with RBM domains and suggests that some of these domains might have evolved to fulfill different roles.