Décryptage des mécanismes moléculaires menant au Spectre Oculo-Auriculo-Vertébral : de la recherche de gène aux modèles animaux

Deciphering the molecular pathways leading to Oculo-Auriculo-Vertebral Spectrum : from gene identification to animal models

• Auteur / Autrice : Aurélien Trimouille
• Direction : Caroline Rooryck Thambo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 16/12/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Maladies rares : génétique et métabolisme (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Pierre Dubus
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Caroline Rooryck Thambo, Pierre Dubus, Alain Verloes, Sylvie Odent, Benoît Arveiler
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alain Verloes, Sylvie Odent

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génomique

Malformations foetales

Modèles animaux

Séquençage à haut débit

Mots clés libres

Spectre Oculo-Auriculo-Vertébral

Séquençage haut-Débit

Modèles animaux

Oculo-Auriculo-Vertebral Spectrum

Next-Generation Sequencing

Animal models

Résumé

Le syndrome de Goldenhar, ou spectre Oculo-Auriculo-Vertébral (OAVS [MIM: 164210]), est une anomalie du développement embryonnaire associant des malformations des structures dérivées des premier et second arcs branchiaux, notamment l'oreille, l'œil, la mandibule et les vertèbres. Il s’agit du deuxième spectre malformatif embryonnaire le plus fréquent de la tête et du cou. Le phénotype clinique esthétérogène et caractérisé par une microsomie hémifaciale, des anomalies auriculaires asymétriques, des dermoïdes épibulbaires, et des malformations vertébrales.Différentes causes non génétiques ont été rapportées dans l’OAVS, dont de nombreuses expositions toxiques (acide rétinoïque, mycophénolate mofetil, etc…). Par ailleurs, une origine génétique de l’OAVS aété rapportée chez des patients porteurs de variants de structure (locus 22q11.2, HMX1, OTX2, etc…), ou devariants ponctuels, touchant notamment MYT1, seul gène rapporté dans plusieurs études.L’objectif de ce travail a été, via l’application du séquençage de l’exome et du génome, d’identifier la ou les causes moléculaires de la survenue de l’OAVS chez des patients issus d’une cohorte de plus de 350 individus,et de confirmer cette identification de gènes par des études fonctionnelles. Celles-ci ont notamment utilisées des analyses en protéomique, à partir de modèles cellulaire et zebrafish, à même de permettre une étude de la morphologie cranio-faciale.Ce travail nous a permis d’identifier 3 gènes responsables d’OAVS : ZYG11B, ZIC3 et EYA3.Le séquençage de l’exome en trio chez un patient nous a permis d’identifier un variant non-sens de novo dugène ZYG11B. L’effet délétère de cette mutation sur la fonction de la protéine a pu être montré par surexpression de la forme mutée sur modèle cellulaire Hela, et par inactivation transitoire de zyg11 parmorpholinos sur modèle zebrafish.Dans une famille où ségrège sur un mode récessif lié à l’X un phénotype OAVS modéré, la réalisation du séquençage d’exomes et d’un génome a pu montrer une association de ces atteintes avec la présence d’une expansion de polyalanines du gène ZIC3.Enfin, nous avons identifié chez deux familles différentes la présence d’un même variant faux-sens du gèneEYA3 ségrègeant avec des atteintes de l’OAVS. L’effet délétère de cette mutation a été confirmé par la réalisation d’études fonctionnelles sur modèle cellulaire et modèle zebrafish, qui présente des malformations cranio-faciales.Par ailleurs, 3 diagnostics différentiels ont pu être fait chez des patients initialement considérés comme atteints d’OAVS, et concernant les gènes SOX5, EFTUD2, et EYA1. Enfin, deux autres gènes candidats ont pu être identifiés, et feront l’objet d’études fonctionnelles : SIX5 et SNRNP70.Si ce travail nous a permis de mieux comprendre les causes moléculaires impliquées dans l’OAVS, ses limites nous imposent de trouver de nouveaux outils pour poursuivre ces investigations. Parmi ceux-ci,l’intégration de technologies OMICs, l’identification de cibles après exposition toxique sur modèle animal,et l’utilisation de méthodes statistiques innovantes appliquées aux analyses génomiques semblent les plus pertinents.

Goldenhar syndrom, or Oculo-Auriculo-Vertebral Sepctrum (OAVS [MIM: 164210]), is an embryonicdevelopmental defect involving the first and second branchial arches. Defects associated with this syndromeare malformations of ears, eyes, mandibles and vertebrae. OAVS is the second most frequent embryonicmalformative spectrum of head and neck. The phenotype is highly heterogeneous, and includes hemifacialmicrosomia, asymmetric auricular dysplasia, epibulbar dermoid and vertebral malformations.Non genetic causes have been reported for OAVS, with several toxic expositions (retinoic acid,mycophenolate mofetil, etc…). Furthermore, genetic causes of OAVS have been described in patientsharbouring structural variants (22q11.2, HMX1, OTX2, etc…), or single nucleotide variants, notably of MYT1gene.The aim of this work is to identify molecular bases of OAVS with exome or genome sequencing, and toconfirm the deleterious effect of variants with functional studies. Notably, we use proteomic analysis oncellular models and zebrafish models, allowing study of craniofacial development.This work identified 3 responsible genes of OAVS: ZYG11B, ZIC3 and EYA3.Trio-based exome sequencing in patient identified a de novo nonsense variant in ZYG11B. The deleteriouseffect of this mutation on protein function has been shown by mutant surexpression in Hela cells, andtransient knockdown by morpholinos in zebrafish model.Exome and genome sequencing in a family affected by X-linked mild OAVS phenotype found an expansionof polyalanines in ZIC3 gene. We also found in two different families affected with OAVS the same missensevariant of EYA3 gene. We confirmed the deleterious effect of this variant with functional studies on Helacells and zebrafish model, which harbour craniofacial defects.Furthermore, differential diagnosis have been found in 3 patients, with mutations in SOX5, EFTUD2, andEYA1 genes. Finally, two other candidate genes have been identified, and will be investigated by functionalstudies: SIX5 and SNRNP70.This work allowed us to better understand molecular causes involved in OAVS. However, its limits force usto find new tools to further investigate this spectrum. Integration of OMICs technologies, toxicologicalstudies on animal models, and innovative biostatistics tools applied to genomic analyses could be relevant