Approche analytique pour des études in vitro d’une échinochandine, la caspofungine

Analytical approach to “in vitro” studies of the chinocandin Caspofungin

• Auteur / Autrice : Beatriz Uribe
• Direction : Karen Gaudin, Rosa Maria Alonso Rojas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Analytique et Environnementale
• Date : Soutenance le 24/07/2020
• Etablissement(s) : Bordeaux en cotutelle avec Universidad del País Vasco. Facultad de ciencias
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Acides Nucléiques : Régulations Naturelle et Artificielle
• Jury : Président / Présidente : Nestor Etxebarria Loizate
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Karen Gaudin, Rosa Maria Alonso Rojas, Nestor Etxebarria Loizate, Eric Marchioni, Rosa Ventura, Tristan Richard, Maria de las Mercedes Catalán
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Marchioni, Rosa Ventura

Mots clés

Mots clés contrôlés

Adsorption

Chromatographie en phase liquide à hautes performances

Caspofungine

Mots clés libres

Caspofungine

Hplc

Adsorption

Résumé

Les infections fongiques invasives ont montré une morbidité et une mortalité croissantes devenant ainsi une préoccupation mondiale. Les principaux responsables de ces infections sont les espèces Aspergillus, Cryptococcus et Candida. Cependant, le genre Candida a attiré l'attention en raison de la mortalité accrue pour certaines populations à risques comme les patients immunodéprimés, où elle peut atteindre 40%.Le traitement pharmacologique de la candidose invasive comprend quatre familles de médicaments antifongiques : les azolés, les polyènes, les analogues de pyrimidine et les échinocandines. L'augmentation de la résistance aux médicaments antifongiques, notamment pour la famille des azolés, a donné lieu au développement de nouveaux antifongiques. Dans ce contexte, les échinocandines sont apparues comme une alternative prometteuse pour les thérapies antifongiques et sont devenues la thérapie de première ligne pour la candidose invasive.Malheureusement, au cours de la dernière décennie, la résistance des espèces de C. glabrata aux échinocandines a également augmenté, notamment à la caspofungine (CSF), qui est un lipopeptide semi-synthétique.Dans ce contexte, l'objectif de ce travail est d’étudier la CSF lors de son utilisation in vitro.Premièrement, une revue bibliographique des méthodes analytiques pour la quantification des échinocandines dans des échantillons biologiques a été réalisée. Sur la base de cette première étape, une approche quantitative a pu être développée et validée utilisant la chromatographie liquide haute performance avec un système de commutation de colonnes et une détection par fluorescence. Cette méthodologie analytique s'est avérée efficace, rapide et sensible pour la quantification de la CSF dans du milieu de culture RPMI-1640 lors d’études in vitro. La commutation de colonnes offre la possibilité d'une injection directe de l'échantillon évitant un traitement préalable et permettant de travailler avec de petits volumes compatible avec des études in vitro.Ensuite, l’étude de la résistance de C. glabrata à la CSF a été envisagée avec l'utilisation d'un modèle in vitro pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD). Ce modèle à deux compartiments a été utilisé pour simuler le profil cinétique de la CSF dans le plasma en présence de C. glabrata. Au cours de cette expérimentation, une perte importante en CSF a été observée, empêchant de mener à bien cette étude avec ce modèle.Sur la base de ces résultats ainsi que le comportement des peptides décrit dans la littérature, nous avons au final étudié la dégradation et d'adsorption de la CSF pour comprendre cette perte. L'étude de dégradation de la molécule a été réalisée par les techniques RMN et LC-MS. Cependant, la dégradation de la CSF s'est avérée être faible en comparaison à son adsorption sur les matériaux.Par conséquent, le phénomène d'adsorption de la CSF a été particulièrement investigué. Divers matériaux de laboratoire ont été testés. De plus, l'impact du pH et la nature du solvant organique pour modifier les solutions de CSF, ont été étudiés pour identifier les conditions qui permettent d’éviter ou au moins limiter l’adsorption. Enfin, différents réactifs pour la modification de surface des matériaux ont été évalués pour les matériaux en verre et en plastique. Les résultats ont montré une diminution de la cinétique d'adsorption de la CSF. Cependant, le traitement a pas suffi pour éviter complètement l'adsorption.

Invasive fungal infections have become a concern around the world due to the morbidity and mortality shown. The main responsible of these infections are Aspergillus, Cryptococcus and Candida genus. However, Candida has gained the attention of specialists due to the mortality shown in some population groups such as immunocompromised, where it can arrive to 40 %.Pharmacological treatment of Invasive candidiasis includes four antifungal drug families: azoles, polyenes, pyrimidine analogues and echinocandins. The increase fungal resistance to drugs, such as azole family, gave rise to the development of new antifungals. In this context, echinocandins emerged as a promising alternative for antifungal therapies and become the first-line therapy for invasive candidiasis in different patient population.Unfortunately, in the last decade resistance of C. glabrata species to echinocandins has risen too, especially to caspofungin (CSF). CSF is a semisynthetic lipopeptide.In this context, the objective of this work presents a deep sight of how to work with CSF in in vitro studies.Firstly, a literature review of the analytical methods developed for echinocandins quantification in biological samples was carefully done. With the information found, a column-switching high performance liquid chromatography coupled to fluorescence detection method was then developed and successfully validated. This analytical methodology demonstrated to be an efficient, rapid and sensible technique for the quantification of CSF echinocandin drug in RPMI-1640 for in vitro studies. Column-switching technique gives the chance of direct injection of the sample with no prior sample treatment and permits researchers to work with small sample volumes, a requirement for in vitro studies.In addition, an attempt of studying C. glabrata’s resistance to CSF has been done. A two compartment pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) in vitro model, was used to simulate the kinetic profile of CSF in plasma. During this experimentation, a analyte loss was observed. Therefore, the resistance study of C. glabrata using this PK/PD model was not possible to perform.Based on the results obtained and the previously reported behaviour of peptides in literature, explanation of this phenomenon was studied taking in consideration both degradation and adsorption processes. Degradation study of the molecule was carried out by NMR and LC-MS techniques. However, the degradation was found to be slightly responsible for the decrease in CSF concentration compared to the adsorption on the materials.Consequently, the adsorption phenomenon of CSF was studied. Various laboratory materials were tested. Furthermore, the impact of the pH value of the solution and the addition of organic modifiers were studied to clarify in which conditions adsorption could be avoided or at least, minimized. Finally, different reagents for material treatment were evaluated for treating glass and plastic material, and its efficacy to avoid adsorption was evaluated. Results shown a decrease in the adsorption kinetic of CSF. However, the treatment was not sufficient to avoid adsorption completely.To summarize, results obtained shown the difficulties of working with CSF in in vitro studies (human body conditions: pH around 7 and in aqueous solution) due to the adsorption phenomenon. This research provides a new perspective to assess the results obtained previously in microbiological and therapeutic fields and, supports researchers to go deeper in the evaluation of the reliability of the methodologies used for resistance determination and drug administration.