Se battre ou fuir ? : mécanismes de tolérance à l'oxygène et morphogenèse des spores dans l'entéropathogène Clostridium difficile

Fight or flight ? : oxygen tolerance mechanisms and spore morphogenesis in the enteropathogen Clostridium difficile

• Auteur / Autrice : Carolina Feliciano
• Direction : Bruno Dupuy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Microbiologie
• Date : Soutenance le 01/02/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Pathogenèse des bactéries anaérobies (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Barbut
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Dupuy, Frédéric Barbut, Aimee Shen, Véronique Broussolle, Philippe Gaudu, Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Aimee Shen, Véronique Broussolle

Mots clés

Mots clés contrôlés

Clostridium difficile

Oxygène

Espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

Spores -- Morphologie (biologie)

Mots clés libres

Protéine Flavodiiron

CotL

Rubrerythrines

Manteau de la spore

Détoxification

Clostridium difficile

Spore morphogenesis

Spore coat

CotL

Oxygen

ROS (Reactive Oxygen Species)

Detoxification

Rubrerythrins

Flavodiiron proteins

Résumé

Clostridium difficile qui est une bactérie anaérobie stricte et sporulante, est laprincipale cause des diarrhées associées à la prise d’antibiotiques. Les spores jouent un rôle central dans le cycle infectieux de C. difficile : résistance en dehors de l'hôte, persistance desbactéries et transmission de l’infection. Lorsqu'elles sont ingérées par l'hôte, les spores de C.difficile germent dans le côlon en présence de certains sels biliaires pour former des cellulesvégétatives qui vont produire des toxines responsables des symptômes.Les cellules végétatives sont exposées à différents stress incluant les espèces réactivesde l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS) produites par le système immunitaire de l’hôte lors del'inflammation. De plus, bien que le tractus intestinal soit considéré comme anoxique, unefaible teneur en oxygène (O2) est présente dans l’intestin et elle va augmenter après untraitement antibiotique. Pour survivre dans cet environnement oxydant hostile, C. difficile adéveloppé des mécanismes de protection, des voies de détoxification et des systèmes deréparation. Le facteur sigma alternatif de la réponse générale au stress, σB, joue un rôleimportant dans la protection de C. difficile face aux stress rencontrés dans l'hôte incluant l’O2et les ROS. Parmi les gènes contrôlés positivement par σB, nous avons identifié des gènescodant pour des protéines probablement impliquées dans la tolérance à l'O2 et ladétoxification des ROS, comme les deux réverses rubrérythrines (revRbrs), CD1524 etCD1474, et les protéines de type flavodiiron (FDPs), CD1157 et CD1623. Nous avons montréque les gènes codant les deux revRbrs et CD1623 sont exprimés sous le contrôle de σB et demanière hétérogène dans la population bactérienne. Le gène CD1157 est lui exprimé à partirde deux promoteurs dépendants l’un de σA et l’autre de σB. Nous avons ensuite montré queCD1157 a une activité O2-réductase alors que les deux revRbrs ont une activité H2O2- et O2-réductase, l’H2O2 étant le substrat préféré. De plus, nous avons montré qu'un double mutantΔCD1474-ΔCD1524 et un mutant CD1157 sont moins tolérants à une faible tension en O2 etque le mutant ΔCD1623 est plus sensible à l'exposition à l’air. Ces résultats démontrent lerôle clé de ces protéines dans la tolérance à l’O2 et la réponse au stress oxydant chez C.difficile. Au cours du cycle infectieux, dans le côlon, certaines cellules végétatives sporulent.Les couches de surface des spores, le manteau et l'exosporium, permettent aux spores derésister aux stress physiques et chimiques. Cependant, peu de choses sont connues sur leursmécanismes d’assemblage. Dans ce travail, nous avons caractérisé une nouvelle protéine,CotL, qui est nécessaire pour l'assemblage des couches externes de la spore. Nous avonsmontré que le gène cotL est exprimé dans la cellule mère sous le double contrôle des facteurssigma de sporulation, σE et σK. La protéine CotL est localisée dans le manteau de la spore, etles spores du mutant cotL ont un défaut morphologique majeur au niveau des couches dumanteau et de l’exosporium. De plus, les spores du mutant contiennent une quantité réduite deplusieurs protéines du manteau et de l’exosporium et présentent un défaut dans leurlocalisation dans des cellules en cours de sporulation. Enfin, les spores du mutant cotL sontplus sensibles au lysozyme et présentent un défaut de germination, un phénotypevraisemblablement associé à la modification de la structure des couches externes de la spore.Ces résultats suggèrent fortement que CotL est une protéine morphogénétique essentielle àl'assemblage des couches externes de la spore chez C. difficile.

The strict anaerobe and sporogenic Clostridium difficile is the most common cause of antibiotic-associated diarrhoea. Spores have a central role in the C. difficile infectious cycle: resistance outside the host, persistence of bacteria during infection and transmission of the disease. When ingested by the host, in the presence of certain bile salts, C. difficile spores germinate in the colon to form vegetative cells that secrete toxins and cause the symptoms of infection. Vegetative cells are exposed to several stresses, among them, reactive oxygen/nitrogen species (ROS/RNS) produced by the host immune system during inflammation. Furthermore, although the intestinal tract is regarded as mainly anoxic, low oxygen (O2) tensions are present in the large intestine and tend to increase after antibiotic treatments. To survive to this hostile oxidative environment, C. difficile had to develop mechanisms of protection, detoxification pathways and repair systems. The alternative sigma factor of the general stress response, ?B, plays an important role in the protection of C. difficile against the different stresses the bacterium is facing inside the host including O2 and ROS. Among the genes positively controlled by ?B, we identified genes encoding proteins likely involved in O2 tolerance and ROS detoxification, such as the two reverse rubrerythrins (revRbrs), CD1524 and CD1474, and the flavodiiron proteins (FDPs), CD1157 and CD1623. We showed that the two revRbrs and the FDP CD1623 are expressed in a ?B-dependent manner and heterogeneously in a cell population. A dual genetic control was demonstrated for the FDP encoding gene CD1157, through ?A- and ?B-dependent promoters. We demonstrated that CD1157 displays O2-reductase activity while the two revRbrs have both H2O2- and O2-reductase activity, being H2O2 the preferred substrate. Moreover, we showed that a double ÆCD1474-ÆCD1524 mutant and a CD1157 mutant are less tolerant to low O2 tension and that the CD1623 mutant is more sensitive to air exposure. These findings demonstrate a key role for these proteins in O2 tolerance and oxidative stress response in C. difficile. During the infection cycle, in the colon some vegetative cells are transformed into spores. The spore surface layers, the coat and exosporium, enable the spores to resist physical and chemical stress. However, little is known about the mechanisms of their assembly. In this work, we characterized a new spore protein, CotL, which is required for the assembly of the spore coat. We showed that the cotL gene is expressed in the mother cell compartment under the dual control of the sporulation sigma factors, ?E and ?K. CotL was localized in the spore coat, and the spores of the cotL mutant had a major morphologic defect at the level of the coat/exosporium layers. Therefore, the mutant spores contained a reduced amount of several coat/exosporium proteins and a defect in their localization in sporulating cells. Finally, cotL mutant spores were more sensitive to lysozyme and were impaired in germination, a phenotype likely associated with the structurally altered coat. Collectively, these results strongly suggest that CotL is a morphogenetic protein essential for the assembly of the spore coat in C. difficile.