Suivi en temps réel des protéines bactériennes sécrétées

Monitoring bacterial secreted proteins in real time

• Auteur / Autrice : Caroline Péron-Cane
• Direction : Nicolas Desprat, Alice Lebreton
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 07/10/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physique statistique de l'École normale supérieure (Paris) - Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Ludovic Jullien
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lydia Robert, Rut Carballido-López
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Javier Pizarro-Cerdà, Mickaël Desvaux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Virulence (microbiologie)

Sécrétion

Protéines bactériennes

Relations hôte-bactérie

Métabolisme

Listeria monocytogenes

Mots clés libres

Facteurs de virulence

Fluorescence

Sécrétion

Dynamique

Listeria monocytogenes

Résidence vacuolaire

Virulence factors

Fluorescence

Secretion

Listeria monocytogenes

Vacuolar residence

Résumé

Lors de l’infection, les bactéries pathogènes déploient un arsenal de facteurs de virulence leur permettant d’envahir leurs organismes cibles. Si nombre de ces effecteurs bactériens ont été bien caractérisés, peu d’outils permettent une étude en temps réel de leur dynamique de sécrétion et de localisation au cours de l’infection. Les marqueurs existants, tels que la GFP (Green Fluorescent Protein) ne peuvent a priori pas passer les systèmes de sécrétion bactériens sous leur conformation active. L’utilisation de FAST (Fluorescence-Activating Shifting Tag) — une sonde dont la fluorescence résulte de la formation d’un complexe avec un ligand diffusant librement au travers des membranes biologiques — permet de s’affranchir de cet obstacle. Lors de ces travaux, j’ai montré que FAST peut être utilisé pour la visualisation d’effecteurs sécrétés par plusieurs systèmes de sécrétion bactériens (T3SS, T5SS et Sec). En mesurant la sécrétion de FAST, nous avons quantifié la dynamique de formation et de rupture des vacuoles d’internalisation occupées par Listeria monocytogenes. En recherchant la localisation de la LLO, l’un des principaux facteurs de virulence sécrétés par L. monocytogenes, j’ai identifié un compartiment dans lequel les bactéries peuvent se répliquer après l’invasion des cellules épithéliales, avant de coloniser le cytoplasme de l’hôte. En plus de valider un outil fluorescent permettant la localisation en temps réel de protéines bactériennes exportées par divers systèmes de sécrétion, cette étude complète le modèle du cycle intracellulaire de L. monocytogenes lors de l’infection de cellules épithéliales.

Upon infection, bacterial pathogens deploy an arsenal of virulence factors promoting the invasion of their host organisms. Although these bacterial effectors have been well characterized, the dynamics of their secretion and of their intracellular localization in the host remain poorly described due to the lack of appropriate tools allowing their visualization in real time. Indeed, common fluorescent tags like GFP (Green Fluorescent Protein) are thought inactive after transport through bacterial secretion systems. To overcome these limitations, we took advantage of FAST (Fluorescence-Activating and absorption Shifting Tag), a tunable fluorescent probe where the fluorescence results from the rapid association with a membrane-permeant fluorogenic ligand. In this work, we showed that FAST can be used to visualize effectors secreted by several bacterial secretion systems (T3SS, T5SS and Sec). By measuring FAST secretion, we quantified the dynamics of formation and rupture of internalization vacuoles occupied by Listeria monocytogenes. Monitoring the location of LLO, a major virulence factor secreted by L. monocytogenes during invasion of epithelial cells, we identified a compartment in which bacteria can replicate, before colonizing the host cytoplasm. In addition to validating a fluorescent tool to monitor the real-time localization of bacterial proteins exported by various secretion systems, this study updates the model of the intracellular cycle of L. monocytogenes during epithelial cell infection.