Caractérisation protéomique par spectrométrie de masse du compartiment hémolymphatique de la moule zébrée Dreissena polymorpha.

Proteomic characterization by mass spectrometry of the hemolymphatic compartment of the zebra mussel Dreissena polymorpha.

• Auteur / Autrice : Maxime Lepretre
• Direction : Alain Geffard, Arnaud Salvador
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et biologie des organismes - populations - interactions
• Date : Soutenance le 04/12/2019
• Etablissement(s) : Reims
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Agriculture, alimentation, biologie, environnement, santé (Paris ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Stress environnementaux et biosurveillance des milieux aquatiques (Reims, Marne ; Le Havre, Seine-Maritime)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Geffard, Arnaud Salvador, Bassem Allam, Florence Geret, Mélissa Palos Ladeiro, Benjamin Morga, Christine Paillard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bassem Allam, Florence Geret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Environnement -- Évaluation du risque

Système immunitaire

Moule zébrée

Résistance aux maladies

Bivalves

Mots clés libres

Protéomique

Hémolymphe

Immunomarqueurs

Système immunitaire

Moule zébrée

Immune system

Proteomics

Hemolymph

Immunomarkers

Zebra mussel

Résumé

L’étude de la modulation du système immunitaire chez les bivalves apparaît comme une stratégie pertinente dans l’évaluation des risques environnementaux. En effet, le système immunitaire des bivalves est connu pour être sensible aux différents stress environnementaux et anthropiques et participe activement à l’élimination des virus, bactéries et autres micro-organismes. Alors que les réponses immunitaires à médiation cellulaires sont bien définies chez la moule zébrée, peu d'informations sont disponibles sur les mécanismes moléculaires associés. Dans ce contexte, l’objectif du projet de thèse est d’acquérir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans l’immunité de la dreissène, ce qui permettra par la suite d’identifier de nouveaux immunomarqueurs chez la moule zébrée. Pour y répondre, différentes stratégies, utilisant la spectrométrie de masse comme outil principal, ont été mises en place. Dans un premier temps, une approche de protéogénomique globale a été menée sur les hémocytes et le plasma afin d’identifier les protéines présentes et de décrire l’implication des deux compartiments dans les réponses immunitaires. Cette stratégie combinant les données transcriptomiques aux données de spectrométrie de masse s’est avérée pertinente puisque nous avons pu établir le plus grand répertoire de protéines connu à ce jour pour cette espèce sentinelle, avec plus de 3 000 protéines identifiées. Plusieurs protéines impliquées dans la reconnaissance, l'internalisation et l'élimination des microorganismes ont été identifiées au sein des hémocytes et du plasma, soulignant l'importance des deux compartiments dans la gestion des molécules du non-soi. Dans un deuxième temps, une approche de protéomique comparative a été réalisée sur des échantillons d’hémolymphe exposés en condition ex vivo à deux stress biologiques : un stress viral (ARN poly I :C) et un stress protozoaire (Cryptosporidium parvum). Les résultats ont montré que de nombreuses protéines impliquées dans la reconnaissance et la destruction des microorganismes étaient modulées dans les deux conditions d'exposition, tandis que les protéines liées à la phagocytose et à l'apoptose étaient exclusivement modulées par C. parvum. D’autres protéines, potentiellement impliquées dans la réponse antivirale de D. polymorpha ont également été spécifiquement modulées par l’ARN poly I :C. Enfin, une méthode de quantification ciblée de ces protéines, par spectrométrie de masse en mode « Selected Reaction Monitoring » (SRM), a été établie afin de doser avec précision des protéines d’intérêts, sélectionnées à partir des approches de découverte. Cette méthode SRM a été utilisée pour quantifier les protéines sélectionnées dans les hémocytes et le plasma à la suite d’expositions in vivo des dreissènes à un contaminant chimique (la caféine) associé ou non aux stress précédents (ARN poly I :C, C. parvum). Les résultats ont permis de souligner l’influence d’un stress chimique sur la réponse de la dreissène exposée à l’ARN poly I :C ou C. parvum. Dans l’ensemble, ce travail de thèse constitue une base solide pour la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l’immunité de la moule zébrée. Les résultats ont permis de mettre en évidence des protéines reflétant un large éventail de mécanismes immunitaires tels que la reconnaissance, l'internalisation et la destruction des microorganismes et ouvrent la voie à l'identification d’immunomarqueurs pour évaluer l'impact des contaminants sur les organismes et les écosystèmes aquatiques.

The study of immune system modulation in bivalves appears to be a relevant strategy in environmental risk assessment. Indeed, the immune system of bivalves is known to be sensitive to various environmental and anthropogenic stresses in addition to participate in the elimination of viruses, bacteria and other micro-organisms. While cell-mediated immune responses are well defined in zebra mussels, informations available on the associated molecular mechanisms are still relatively scarce. In this context, the aim of the thesis is to acquire a better knowledge of the molecular mechanisms involved in the immunity of Dreissena polymorpha, in order to identify new immunomarkers of zebra mussels. For that purpose, several strategies were applied, using mass spectrometry as the main tool. Firstly, a global proteogenomic analysis was conducted on hemocytes and plasma of D. polymorpha to identify proteins and describe the involvement of both compartments in immune responses. This strategy, combining transcriptomic data with mass spectrometry data was relevant since we established the largest protein repertoire known to date for this sentinel species, with over 3,000 proteins identified. Several proteins involved in the recognition, internalization and elimination of microorganisms were mapped in hemocytes and plasma, highlighting the importance of both compartments in the management of non-self molecules. In a second step, a differential proteomic analysis was carried out on hemolymph samples exposed ex vivo to two biological stresses: a viral stress (RNA poly I:C) and a protozoan stress (Cryptosporidium parvum). Results showed that many proteins involved in the recognition and destruction of microorganisms were modulated under both exposure conditions, while proteins related to phagocytosis and apoptosis process were exclusively modulated exclusively by C. parvum. Other proteins, potentially involved in the antiviral response of D. polymorpha were also modulated exclusively by the RNA poly I:C. Finally, a targeted quantification method, by mass spectrometry in "Selected Reaction Monitoring" (SRM) mode, was developed in order to accurately quantify immune proteins, selected from previous discovery proteomics results. This SRM method was used to quantify targeted proteins in both hemocytes and plasma following in vivo exposures of zebra mussels to a chemical contaminant (caffeine) associated or not with previous stresses (poly RNA I:C, C. parvum). In addition to validated the involvement of targeted proteins in the response to C. parvum and RNA poly I:C, results highlighted the influence of chemical stress on the response of D. polymorpha exposed to RNA poly I:C or C. parvum. Overall, this work provides a solid basis for understanding the molecular mechanisms involved in D. polymorpha immunity. Results have highlighted proteins that reflect a wide range of immune mechanisms such as the recognition, internalization and destruction of microorganisms. This study paves the way for the identification of new immunomarkers to assess the impact of contaminants on aquatic organisms and ecosystems.