Cascade bi-enzymatique autosuffisante in vivo : le jeu des plasmides
Auteur / Autrice : | Sidiky Menil |
Direction : | Véronique Alphand, Katia Duquesne |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Sciences Chimiques |
Date : | Soutenance le 31/01/2018 |
Etablissement(s) : | Aix-Marseille |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Sciences Chimiques (Marseille ; 1996-....) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Institut des sciences moléculaires de Marseille (ISM2) |
Jury : | Président / Présidente : Marius Réglier |
Examinateurs / Examinatrices : Caroline Paul, Véronique de Berardinis | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Gefflaut, Eric Dubreucq |
Mots clés
Mots clés contrôlés
Résumé
Une attention croissante est portée aux cascades multi enzymatiques pour l’élaboration de procédés de synthèse plus efficaces. Cependant, le contrôle de l’expression hétérologue de plusieurs gènes dans un même hôte s’avère difficile et peut mener à un déséquilibre du flux réactionnel. Pour exploiter au mieux les avantages d’une cascade in vivo, il est nécessaire d’ajuster les activités de chaque étape, et de construire des catalyseurs cellulaires capables de programmer la stœchiométrie des enzymes. Nous avons développé dans ce projet une approche originale pour moduler le ratio de deux enzymes in cellulo en jouant sur le nombre de copies de plasmides par cellule (PCN). Nous avons choisi comme modèle un système autosuffisant associant une Alcool Déshydrogénase (ADH) et une Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), NADP(H)-dépendantes. Plusieurs plasmides recombinants portant les deux gènes ont été conçus et combinés dans E. coli. Les souches de co-expression construites ont été comparées en termes de PCN, de production d’enzymes et d’activité. Nous avons montré l’importance d’un choix judicieux de la combinaison de plasmides ainsi que l’existence d’une corrélation entre ratios d’enzymes et activité. Nos biocatalyseurs s’étendent sur une gamme allant du système inactif à un système affichant un TTN d’environ 6000. Ce système a permis la synthèse de lactones d’intérêt industriel, la dihydrocoumarine et la caprolactone, à partir d’indanol et de cyclohexanol. Enfin, sur ce modèle de combinaison de plasmides, trois nouveaux biocatalyseurs cellulaires, associant l’ADH à diverses BVMOs, ont été créés afin d’élargir la gamme d’esters et de lactones synthétisables à partir d’alcools.