Etude de l’anthocyanidine synthase de Vitis vinifera : substrats polyphénoliques et mécanismes réactionnels

Study of anthocyanidin synthase from Vitis vinifera : polyphenolic substrates and reactional mechanisms

• Auteur / Autrice : Jiarong Zhang
• Direction : Jean Chaudière, Jean-Marie Schmitter
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 15/12/2017
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux ; 2007-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Boschi-Muller, Olivier Dangles
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ariane Jalila Simaan, Véronique Cheynier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anthocyanes

Glutathion

Polyphénols végétaux

Mots clés libres

Anthocyanidine synthase

Oxygénase

Oxoglutarate

Ascorbate

Glutathion

Leucocyanidine

Anthocyanidin synthase

Oxygenase

Oxoglutarate

Ascorbate

Glutathione

Leucocyanidin

Résumé

L’ANS recombinante de Vitis vinifera (VvANS) a été exprimée chez E. coli, et purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne Nickel. La production et purification de l'holoenzyme chargée en fer a été mise en point, afin d’éviter les réactions d'oxydation non-enzymatique incontrôlée en présence de sel de Fe(II). Un complexe VvANS-Fe(II) stable est formé en présence d'α- cétoglutarate et d'ascorbate, complexe qui est catalytiquement actif à PO2 ambiante en l'absence de sel de Fe(II). La transformation de la (+)-catéchine par VvANS a été étudiée avec ou sans ascorbate, en utilisant le complexe VvANSFe( II) ou l’holoenzyme co-incubée en présence de sulfate ferreux, afin d’étudier le rôle de l’ascorbate. Aucune activité enzymatique n’a été observée en l'absence d’ascorbate, ce qui indique qu'il s'agit d'un cofacteur indispensable de VvANS. Un adduit covalent ascorbate-cyanidine est produit in vitro, mais seulement en l'absence d'un autre réducteur nucléophile majeur, le glutathion GSH. Les deux stéréoisomères de la leucocyanidine (flavan-diols 3,4-cis et 3,4-trans), substrats potentiels de VvANS, mais non commerciaux, ont été synthétisés par réduction de la dihydroquercétine par NaBH4, puis identifiés par RMN du proton. L'analyse des deux stéréoisomères par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) montre que leurs voies de fragmentation MS/MS sont distinctes et peuvent être utilisées pour les distinguer lors de leur production. Les deux stéréoisomères sont stables en milieu aqueux congelé à -20°C. Douze flavonoïdes de quatre familles distinctes (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) ont été testés comme substrats potentiels. Tous les produits enzymatiques ont été purifiés par HPLC en phase inverse, puis identifiés par MS/MS, avec les résultats suivants: 1) Seuls les dihydroflavonols de configuration (2R,3R) sont acceptés comme substrats par VvANS dont l'activité diminue avec le nombre de groupements hydroxyles du cycle B. 2) Seuls les flavan-3-ols ou flavan-3,4-diols de configuration (2R,3S) ayant un catéchol ou trois OH phénoliques vicinaux sur le cycle B sont acceptés comme substrats. 3) La naringénine n'est pas substrat de VvANS, sans doute en raison de l'absence de groupement hydroxyle en C3. […] Le glutathion GSH est un puissant nucléophile, réducteur et piégeur de radicaux libres, qui est abondant dans la baie de raisin. Nous avons donc étudié son effet sur l'activité de VvANS avec tous les substrats identifiés. GSH n’a pas d'effet sur la transformation des dihydroflavonols et des flavan-3,4-diols, mais il modifie considérablement le mode de transformation de la (+)-catéchine et de la (+)-gallocatéchine. En présence de (+)-catéchine et de GSH, on observe deux produits majeurs, la cyanidine et un adduit thioéther cyanidine-glutathion, et le rendement de production est beaucoup plus élevé qu'en l'absence de GSH. De plus, l’adduit covalent ascorbate-cyanidine et le dimère issu de la (+)-catéchine obtenus lors de la réaction réalisée en l'absence de GSH ont disparu. Nos données suggèrent que l'adduit covalent cyanidine-glutathion est un thioéther en C4 qui fait l'objet d'un équilibre de tautomérisation céto-énolique en C3, et se décompose en cyanidine et GSH. En présence de (+)-gallocatéchine, un adduit thioéther similaire delphinidine-glutathion est aussi observé. Pour tester l'éventuelle spécificité de GSH, trois autres mercaptans (thiomalate, cystéine et cystéamine) ont été testés et aucun adduit similaire n’a été observé, ce qui suggère que GSH est un ligand spécifique, et pourrait être un coenzyme de VvANS. Nos résultats suggèrent que les anthocyanidines pourraient être produites in vivo à partir d'un substrat flavan-3-ol (catéchine ou gallocatéchine) via un intermédiaire thioéther de glutathion, alors que le stéréoisomère naturel (3,4-cis) de la leucocyanidine n'est pas transformé en cyanidine.

Recombinant anthocyanidin synthase from Vitis vinifera (VvANS) has been expressed in E. coli, and purified by nickel affinity chromatography. The production and purification of the iron-loaded enzyme has been developed in order to avoid uncontrolled nonenzymatic oxidation reactions in the presence of Fe(II) salt. A stable VvANS-Fe(II) complex is formed in the presence of 2-oxoglutarate and ascorbate, and this complex is catalytically active at ambient PO2 in the absence of Fe(II) salt. The transformation of (+)-catechin by VvANS has been studied with and without ascorbate, by using either the VvANSFe( II) complex or the holoenzyme co-incubated with ferrous sulfate, to investigate the role of ascorbate. No enzyme activity has been observed in the absence of ascorbate, which means that it is an essential enzyme cofactor. A covalent adduct ascorbate-cyanidin is produced in vitro, but only in the absence of glutathione (GSH), another major nucleophilic and reducing agent. The two stereoisomers of leucocyanidin (3,4-cis et 3,4-trans flavan-diols) which were expected to behave as substrates of VvANS, are not commercial and were synthesized by reduction of dihydroquercetin by NaBH4, and characterized by proton NMR. The analysis of the two stereoisomers by means of tandem mass spectrometry (MS/MS) shows that their fragmentation pathways are distinct and may be used to distinguish them during their production. The two stereoisomers are stable in frozen aqueous medium at -20°C. Twelve flavonoids of four distinct families (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) were tested as potential substrates of VvANS. All enzymatic products were purified by means of reverse-phase HPLC and characterized by MS/MS, with the following results: 1) Only dihydroflavonols of (2R,3R) configuration are accepted as substrates by VvANS, the activity decreasing with the number of hydroxyl groups of ring B. 2) Only flavan-3-ols or flavan-3,4-diols of (2R,3S) configuration having either a catechol or three vicinal phenolic OH on ring B are accepted as substrates. 3) Naringenin is not substrate of VvANS, most likely because a C3 hydroxyl group is missing. […] Glutathione GSH is a powerful nucleophilic and reducing agent as well as a free radical scavenger, which is abundant in grape berries. We therefore studied its effect on VvANS activity with all identified substrates. GSH has no effect on the transformation of dihydroflavonols and flavan-3,4-diols, but it considerably modifies the transformation pattern of (+)- catechin and (+)-gallocatechin. In the presence of (+)-catechin and GSH, we observe two major products, cyanidin and a cyanidin-glutathione thioether, with production yields which are much higher than in the absence of GSH. Moreover, the ascorbate-cyanidin covalent adduct and the (+)-catechin dimer that had been obtained in the absence of GSH have disappeared. Our data suggest that the cyanidin-glutathione adduct is a C4-thioether which is in equilibrium between the two keto-enolic tautomeric forms at C3, and decomposes into cyanidin and GSH. In the presence of (+)-gallocatechin, a similar delphinidin-glutathione thioether adduct is also observed. In order to test the possible specificity of GSH as a cofactor, three other mercaptans (thiomalate, cysteine and cysteamine) were tested, and no similar product was observed, which suggests that GSH is a specific ligand, and might be a coenzyme of VvANS. Our results suggest that anthocyanidins could be produced in vivo from a flavan-3-ol substrate (catechin or gallocatechin) via a glutathione thioether intermediate, whereas the natural 3,4-cis stereoisomer of leucocyanidin is not transformed into cyanidin by VvANS.