Thèse soutenue

Développement d'outils enzymatiques pour la synthèse de protéines S-glycosylées
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Auteur / Autrice : Laure Guillotin
Direction : Richard Daniellou
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie
Date : Soutenance le 12/11/2015
Etablissement(s) : Orléans
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie organique et analytique (Orléans ; 2012-....)
Jury : Président / Présidente : Arnaud Tatibouët
Examinateurs / Examinatrices : Richard Daniellou, Arnaud Tatibouët, Magali Remaud, Samir Messaoudi, Ludovic Landemarre, Pierre Lafite
Rapporteurs / Rapporteuses : Magali Remaud, Samir Messaoudi

Mots clés

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Résumé

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Dans la communauté scientifique, la glycosylation suscite un vif intérêt tant les relations existantes entre les sucres et les protéines sont étroites et sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. De nombreuses méthodologies de synthèse ont été développées pour permettre la production de glycoprotéines sous forme homogènes nécessaires pour leur étude. Les formes S-glycosidiques sont d’un intérêt particulier grâce notamment à la réactivité de l’atome de soufre qui permet le couplage spécifique sucre – acide aminé et qui confère à la liaison une relative résistance à l’hydrolyse acido/basique et enzymatique. Dans le cadre de ce projet nous avons souhaité utiliser des outils biocatalytiques pour proposer une nouvelle voie d’accès aux protéines S-glycosylées en s’appuyant sur le concept des thioglycoligases. Pour répondre à ce challenge, nous nous sommes intéressés à la production d’une banque de glycosidases natives à partir du génome de la bactérie thermophile Dictyoglomus thermophilum. Trois protéines originales ont pu être produites, caractérisées et criblées en activité transglycosylase. Parmi ces dernières la β-glycosidase DtGly s’est révélée être un biocatalyseur efficace en favorisant la synthèse d’une variété de glycosides d’alkyle et de glycosyl glycérol. Par la suite, neuf mutants thioglycoligases ont été produits par mutagénèse dirigée à partir des glycosidases natives. A l’issue de leur criblage en activité thioligase, le mutant de DtGly E159Q a été retenu pour la synthèse de S-glycoconjugués. Une étude de relation structure/activité menée sur l’enzyme mutée nous a conduit à la synthèse d’un acide aminé non-naturel, la Thiotyrosine. L’essai de glycosylation de l’analogue estérifié de cette Thiotyrosine par DtGly E159Q a été suivi par LC-MS et a permis de mettre en évidence la formation du produit de thioglucosylation. Ce premier résultat préliminaire s’avère très prometteur pour la validation du concept de S-glycosylation d’un acide aminé catalysée par une thioglycoligase.