Développements méthodologiques RMN 13C isotopique pour l'étude de voies métaboliques

Methodological developments in isotopic 13C NMR for studies of metabolic pathways

• Auteur / Autrice : Kevin Bayle
• Direction : Gérald Remaud, Serge Akoka
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie, Chimie analytique
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Matériaux, Matières, Molécules en Pays de la Loire (3MPL) (Le Mans2008-2021)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie Et Interdisciplinarité : Synthèse, Analyse, Modélisation (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques
• Jury : Président / Présidente : Richard J. Robins
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gérald Remaud, Serge Akoka, Richard J. Robins, Jean-Michel Franconi, Philippe Lesot
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Michel Franconi, Philippe Lesot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycolyse

Effet isotopique

Mots clés libres

Fractionnement isotopique

RMN-13C isotopique

Référence interne 13C isotopique

Fermentations

Résumé

Le but de l’étude menée au cours du travail de thèse a été la détermination d’effets isotopiques associés à trois voies métaboliques (Embden-Meyerhof-Parnas, Entner-Doudoroff et phosphocétolase) par le biais de fermentations de micro-organismes et levures effectuant la biotransformation du glucose en éthanol et acide lactique. Dans un premier temps, une réflexion a été menée sur les paramètres analytiques nécessaires à l’analyse d’acides carboxyliques par RMN 13C isotopique. Les questionnements soulevés par l’analyse de l’acide acétique ont amené à élargir l’étude et prendre en compte une gamme plus large de molécules. L’ensemble de ces travaux constitue de ce fait une évaluation des conditions nécessaires à l’obtention de mesures exactes en RMN 13C isotopique indépendamment du spectromètre utilisé. De plus, la mesure par RMN-13C isotopique, utilise jusqu’à présent la teneur globale 13C, mesurée par SMRI. La détermination des fractions molaires mesurées en RMN permet l’obtention des teneurs intramoléculaires 13C. L’implémentation d’une méthode de référencement interne pour le carbone a nécessité la prise en compte de nombreux paramètres et a donc requis un développement conséquent dont la validation quantitative d’une nouvelle séquence RMN 1H visant à éliminer le « radiation damping ». Grâce à une méthodologie juste et précise, nous avons mis en évidence la présence d’effets isotopiques intramoléculaires supposés, apparents, associés aux voies métaboliques, malgré qu’ils soient relativement faibles. Ceux-ci diffèrent d’une voie à l’autre, en accord avec la formation de métabolites différents au cours de réactions enzymatiques caractéristiques à chaque voie.

The aim of the study has been the determination of isotope effects associated with three metabolic pathways (Embden-Meyerhof-Parnas, Entner-Doudoroff and phosphoketolase) using fermentation by yeasts and microorganisms bio-transforming glucose into ethanol and lactic acid. Initially, a study was conducted on the analytical parameters required for the analysis of carboxylic acids by 13C iq-NMR. Doubts raised in relation to the analysis of acetic led to the study being expanded to include a wider range of molecules. This section of the work is therefore composed of an assessment of the conditions for obtaining accurate measurements of 13C iq-NMR regardless of the spectrometer used. The current strategy to access the site-specific 13C measurements (δ13Ci) is dependent on the δ13Cg, obtained by IRMS, coupled with the determination by 13C iq-NMR of the molar fraction for each carbon measured. The implementation of the same methodology for 13C iq-NMR has required many factors to be taken into consideration. Establishing an analytical protocol for the implementation of an internal standard for 13C iq-NMR has required significant development, with the quantitative validation of a new 1H NMR sequence aiming to eliminate radiation damping. Thanks to the accurate methodology established, we have been able to detect the presence of relatively small intramolecular kinetic isotope effects associated with the metabolic pathways studied. Each pathway gives a characteristic isotopic signature, consistent with the formation of metabolites produced by the specific enzymatic reactions. The 13C isotope effects obtained are in agreement with the reactions that characterise each pathway.