Incorporation de protéines membranaires produites par un système d'expression protéique acellulaire dans des bicouches lipidiques planes

Incorporation of membrane proteins produced by a cell-free expression system into planar lipid lilayers

• Auteur / Autrice : Angelique Coutable
• Direction : Jean-Marie François, Christophe Thibault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie Microbienne et Enzymatique
• Date : Soutenance le 14/03/2014
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'ingénierie des systèmes biologiques et des procédés (Toulouse) - Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés [LISBP]
• Jury : Président / Présidente : Christophe Vieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Marie François, Christophe Thibault, Jean-Luc Lenormand
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olivier Francais, Pierre-Emmanuel Milhiet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines membranaires

Mots clés libres

Système d'expression acellulaire

Bicouche lipidique plane

Alpha hémolyse

Aquaporine Z

Protéine membranaire

Transcription traduction in vitro

Bicouche lipidique espacée

Free-cell expression system

Planar lipid bilayers

Alpha hemolysin

Aquaporin Z

Membrane protein

In vitro translation traanscription

Tethered lipid bilayer

Résumé

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnelles.

Integral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional.