Développement de méthodes bioanalytiques à base d’aptamères pour la détermination de l’ochratoxine A dans les denrees alimentaires

• Auteur / Autrice : Amina Rhouati
• Direction : Jean-Louis Marty, Zahia Meraihi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biochimie, biotechnologies et environnement
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Perpignan en cotutelle avec Université Constantine 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Énergie environnement (Perpignan ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biocapteurs-Analyses-Environnement (Perpignan)
• Jury : Président / Présidente : Hacène Bousseboua
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Charles Ghommidh
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Annie Pfohl-Leszkowicz, Daoud Harzallah

Mots clés

Mots clés contrôlés

Aptamères

Aliments

Mycotoxines

Mots clés libres

Mycotoxines

Ota

Selex

Aptamères

Oligoadsorbant

Aptacapteur

Extraction

Détection

Résumé

L’ochratoxine A ou OTA, mycotoxine de structure isocoumarinique chlorée, produite par les genres Aspergillus et Penicillium, est un contaminant de plusieurs produits alimentaires. Même à l’e��tat de traces, l’OTA possède des effets néfastes sur la santé humaine et animale: effets néphrotoxiques, tératogènes, immunosuppressives, neurotoxiques et cancérogènes du groupe 2B (l’OTA a été considérée par l’IARC comme un cancérogène possible pour l’homme). Pour éviter ces problèmes de santé publique, plusieurs directives préconisent de limiter la présence de l’OTA dans divers aliments. Dans le but d’assurer la sécurité alimentaire et par respect des normes européennes, plusieurs méthodes analytiques, principalement basées sur des techniques chromatographiques, ont vu le jour. Malgré leur efficacité, ces méthodes demeurent très coûteuses et nécessitent un personnel qualifié, d’où l’intérêt de développer de nouvelles technologies basées sur les méthodes biochimiques. Le principe de ces techniques est basé sur une interaction molécule cible-élément de reconnaissance. On utilise dans ce travail de thèse une nouvelle classe de molécules appelées : les aptamères. Ce sont des séquences oligonucléotidiques ADN ou ARN simple ou double brins, sélectionnés selon leur aptitude à reconnaitre une cible par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponantial enrichment). L’objectif du présent travail est de développer de nouvelles méthodes à base d’aptamères pour la détermination de l’OTA dans les denrées alimentaires. Nous allons mettre au point deux méthodes: une méthode d’extraction et une méthode de détection. La première consiste en un oligoadsorbant ou colonnes d’affinité à base d’aptamères. La performance de cet outil d’extraction est évaluée en termes de rétention, spécificité, sélectivité et régénération. La seconde méthode est basée sur un aptacapteur développé dans un système entièrement automatisé en flux où toutes les manipulations et les optimisations sont effectuées par des séquences automatiques. Après optimisation, ces méthodes sont appliquées sur des échantillons réels de bière. Les limites de détection obtenues sont beaucoup inférieures aux normes fixées par la Commission Européenne. Les limites de détection et les rendements obtenus ont pu démontrer la faisabilité ainsi que l’intérêt potentiel de telles techniques analytiques pour des échantillons réels sans effets de matrice.

Ochratoxin A (OTA), an isoucoumarinic mycotoxin produced by the genra Aspergillus and Penicillium, is a common contaminant of several foodstuffs. Even in trace amounts, OTA has adverse affects on human and animal health: nephrotoxic, teratogenic, neurotoxic, immunosuppressive and it was considered by the international Agency of Research on Cancer (IARC) as a potential carcinogenic agent (group 2B). In order to meet food safety concerns and official legislated regulations, analytical methods, mainly based on chromatographic techniques, have been reported for OTA detection. Despite their effectiveness, these techniques remain expensive and require qualified skilled personnel, alternatives strategies are emerging and novel technologies based on biochemical methods. These techniques are based on the interaction target-recognition element. We use in this work, a new class of biomolecules called aptamers. They are single or double stranded DNA or RNA, selected by their ability to recognise a target, by a combinatorial method of selection in vitro called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponantial enrichment). The aim of this work is the development of new methods based on aptamers for OTA determination in foodstuffs. We will develop two methods, one method for extraction and another one for detection. The first one consists in an aptamer-based affinity column or oligosorbent. This device of extraction was evaluated in term of retention, specificity, selectivity and regeneration. While the second is based on an aptasensor developed in a fully automated system. All the optimizations and manipulations were performed using automated sequences. After optimizations, these two methods are applied for OTA determination in real beer samples. The obtained limits of detection are much lower than the maximum tolerated levels of OTA in set by the European commission. Also, the high recovery yields obtained show the good applicability of the developed oligosorbent and aptasensor in real sample without matrices effect.