Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des furocoumarines chez les végétaux supérieurs

Identification and functional characterization of genes involved in furocoumarines biosynthesis by higher plants

• Auteur / Autrice : Guilhem Vialart
• Direction : Frédéric Bourgaud, Alain Hehn
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences Agronomiques
• Date : Soutenance le 06/04/2012
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : RP2E - Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie des Ressources, Procédés, Produits, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire agronomie et environnement (Vandoeuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Nathalie Guivarc'h
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Éric Gelhaye
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Hugueney, Hubert Schaller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plantes -- Expression génique

Cytochrome P450

Biosynthèse

Psoralènes

Mots clés libres

Dioxygénase Fe/alpha cétoglutarate-dépendante

Cytochrome P450

P-coumaroyle CoA

Umbelliférone

Furocoumarines

Expression transitoire

Ruta graveolens

Fe/alpha-oxoglutarate-dependent dioxygenase

Cytochrome P450

P-coumaroyle CoA

Umbelliferone

Furanocoumarins

Transient expression

Ruta graveolens

Résumé

Les furocoumarines sont des métabolites secondaires qui dérivent de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Ces phytoalexines interviennent notamment dans les mécanismes de défense des plantes tels que la résistance aux bioagresseurs. Le déterminisme moléculaire de cette voie de biosynthèse est encore mal connu mais il a néanmoins été démontré depuis les années 1960 que les enzymes catalysant les différentes étapes de la voie la synthèse des furocoumarines appartenaient à différentes familles. Les travaux présentés dans ce document se sont focalisés sur deux familles d'enzymes : les dioxygenases oxoglutarate dépendantes et les cytochromes P450s. La première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines consiste en une ortho-hydroxylation du p-coumarate qui mène à la formation de l'umbelliférone. Basé sur des travaux récents sur Arabidopsis, six gènes codants pour des dioxygénases ont été isolés chez Ruta graveolens, Citrus limetta et Pastinaca sativa. Les protéines correspondantes présentent plus de 58% d'identité avec la Féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H) d'A. thaliana. La caractérisation fonctionnelle de ces enzymes a été réalisée dans un système d'expression hétérologue procaryote. Sur les 6 enzymes, trois n'ont pu être exprimée efficacement, et deux présentent une activité F6'H similaire à celle décrite pour A. thaliana. La dernière enzyme dispose de caractéristiques nouvelles non décrites à ce jour. Elle est en mesure de réaliser l'hydroxylation du féruloyle coA et du p-coumaroyle coA. Ces études in vitro ont été complétées par une exploration des fonctions de la protéine dans la plante. Une analyse fine du profil d'expression du gène a permis de mettre en évidence une expression qui est en corrélation avec le niveau de production d'umbelliférone. La fonction de la protéine a également été validée par une analyse des produits formés dans des feuilles de Nicotiana benthamiana transformées transitoirement. Les cytochromes P450 catalysent 60% des réactions de la voie de biosynthèse de furocoumarines. Un travail de criblage fonctionnel de cytochromes P450 identifiés au préalable chez Ammi majus et Thapsia garganica a été entrepris. Les analyses de bio-informatiques et les modifications apportées au niveau du mode opératoire pour l'expression dans la levure ont permis d'émettre des hypothèses concernant le rôle de certains P450 candidats. Ces travaux exploratoires et préliminaires font supposer de nouvelles conjectures relatives à cette voie de biosynthèse

Furanocoumarins are secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These phytoalexins are especially involved in plant defense mechanisms against insects or phytopatogenous fungi and bacteria. The molecular control of this biosynthetic pathway is still poorly understood even though it has been demonstrated since the 1960s that enzymes catalyzing the different steps are belonging to different enzymatic families. The work presented here is focused on two enzyme families: oxoglutarate dependent dioxygenases and cytochrome P450s. The first step in the furanocoumarins biosynthetic pathway is the ortho-hydroxylation of p-coumarate, which leads to the formation of umbelliferone. Based on a recent work done on Arabidopsis, we isolated six genes encoding dioxygenases from Ruta graveolens, Citrus limetta and Pastinaca sativa. The corresponding proteins share more than 58% identity with the A. thaliana féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H). The functional characterization of these enzymes was performed in a prokaryotic heterologous expression system. Of the six enzymes, three could not be functionnaly expressed and two exhibited a similar F6'H activity as described for A. thaliana. The last enzyme has new properties not described to date. It is able to achieve both hydroxylation of féruloyle CoA and p-coumaroyle CoA. These in vitro studies were completed by a functional exploration of the protein in planta. A detailed analysis of the gene expression pattern highlighted a link with the level of umbelliferone synthesis. The function of the protein was also confirmed by an analysis of the products formed in transiently transformed Nicotiana benthamiana leaves. Cytochrome P450s catalyze 60% of the reactions of the furanocoumarin biosynthetic pathway. Therefore, a functional screening of cytochrome P450 previously identified in Ammi majus and Thapsia garganica was undertaken. The bioinformatic analyses and the changes undertaken in the procedure for expression in yeast allowed drawing hypotheses on the function of some of these P450 candidates. These exploratory and preliminary experiments allowed suggesting new hypotheses about the biosynthetic pathway