Caractérisation du chromoplaste de tomate par approche protéomique

Characterization of tomato fruit chromoplasts by proteomic approach

• Auteur / Autrice : Cristina Ioana Barsan
• Direction : Jean-Claude Pech, Aurelia Brezeanu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Développement des plantes
• Date : Soutenance le 10/11/2010
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT en cotutelle avec Institut de biologie (Bucarest)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomique et Biotechnologie des Fruits (Castanet-Tolosan, Haute-Garonne ; 1995-....)

Mots clés

Mots clés libres

Tomate

Isolement

Chromoplaste

Protéomique

Transition chloroplaste-chromoplaste

Microscopie confocale et de fluorescence

Tomato

Isolation

Chromoplast

Proteomics

Chloroplast to chromoplast transition

Confocal and fluorescence microscopy

Résumé

La maturation des fruits est un processus complexe, principalement régulé par l'hormone végétal éthylène, qui entraîne d'importants changements métaboliques et physiologiques, ayant pour résultat la dispersion des graines. Le changement le plus visible qui se produit pendant la maturation des fruits est le changement de couleur. L'organite responsable de ce phénomène est le chromoplaste, lieu d’accumulation des caroténoïdes. Toutefois, ce n'est pas son unique rôle. Il a été montré qu’il est aussi impliqué dans la biosynthèse des lipides, de l’amidon, des vitamines et des arômes. Parce que la plupart des protéines (95%) qui composent le protéome du chromoplaste sont codées par le noyau, l’approche génomique n'est pas suffisante pour connaître les fonctions de chromoplaste dans la synthèse des métabolites d'intérêt. La protéomique de haut débit associée à la bio- nformatique a été utilisée pour caractériser le chromoplaste de tomate. L’analyse du protéome de chromoplastes de fruits de tomate rouges a révélé la présence de 988 protéines correspondantes à 802 unigènes d’Arabidopsis, dont 209 n’ont pas été répertoriés jusqu'à présent dans des banques de données plastidiales. Ces données ont révélé plusieurs caractéristiques du chromoplaste. Les protéines du métabolisme des lipides et de trafic sont bien représentées, y compris toutes les protéines de la voie de la lipoxygénase nécessaire à la synthèse des arômes volatiles dérivés de lipides. Les protéines impliquées dans la synthèse de l'amidon coexistent avec plusieurs protéines qui dégradent l'amidon. Les chromoplastes ne contiennent plus les protéines de biosynthèse de la chlorophylle mais contiennent des protéines impliquées dans la dégradation de la chlorophylle. Aucun des protéines impliquées dans le mécanisme de transport thylacoïdal n’ont été trouvées. Étonnamment, les chromoplastes contiennent l'ensemble des protéines du cycle de Calvin, y compris la Rubisco, ainsi que la voie des pentoses phosphates (OxPPP). L'analyse de l'évolution du transcriptome des gènes codant pour des protéines chromoplastiques a été réalisée. Ces données ont confirmé la réduction de la photosynthèse et le maintien du cycle de Calvin, ainsi que la biosynthèse de l'amidon et des lipides. Des analyses biochimiques complémentaires ont montré dans des chromoplastes isolés la présence d’une activité de deux enzymes importantes dans la biosynthèse des arômes (lipoxygénase et l'alcool déshydrogénase). Par ailleurs, à l’aide du couplage de protéines à la GFP et à leur expression dans des protoplastes, nous avons montré que des protéines ne présentant pas de peptide signal peuvent être localisées dans le chromoplaste. Enfin, un protocole d'isolement des plastes de fruits de tomate à différents stades de maturation a été mis au point et les fractions plastidiales ainsi obtenues ont été caractérisées par la microscopie confocale à balayage laser. La transition du chloroplaste à chromoplaste est un processus qui n'a jamais été décrit par la protéomique. Ce travail est en cours et devrait répondre à certaines questions concernant les changements qui ont lieu dans l'organite, et apporter des informations nouvelles pour la compréhension de la maturation des fruits.

Fruit ripening is a complex process, mainly regulated by the fruit hormone ethylene, resulting in significant metabolic and physiological changes, having as outcome seed dispersal. The most flagrant change taking place during ripening is the change in color. The organelle responsible for this is the chromoplast, the place of carotenoids accumulation. However this is not its unique role. It was found to be involved in lipid, starch, vitamins and aroma biosynthesis. Due to the fact that most proteins (95%) composing the chromoplast are codified by the nucleus knowledge on gene expression and genome sequences is not useful in the investigation of the functions of chromoplast in the synthesis of the metabolites of interest. High- hroughput proteomics associated with bio-informatics was used to characterize the tomato chromoplast and to reveal its intimate structure. Analysis of the proteome of red fruit chromoplasts revealed the presence of 988 proteins corresponding to 802 Arabidopsis unigenes, among which 209 had not been listed so far in plastidial data banks. These data revealed several features of the chromoplast. Proteins of lipid metabolism and trafficking were well represented, including all the proteins of the lipoxygenase pathway required for the synthesis of lipid-derived aroma volatiles. Proteins involved in starch synthesis co- xisted with several starch-degrading proteins and starch excess proteins. Chromoplasts lacked proteins of the chlorophyll biosynthesis branch and contained proteins involved in chlorophyll degradation. None of the proteins involved in the thylakoid transport machinery were discovered. Surprisingly, chromoplasts contain the entire set of Calvin cycle proteins including Rubisco, as well as the oxidative pentose phosphate pathway (OxPPP). The analysis of the evolution of the transcriptome of chromoplastic protein-encoding genes was performed. This data confirmed the reduction of the photosynthesis and the maintenance of the Calvin cycle, and of the lipid and starch biosynthesis. Further analysis is performed showing the activity of two important actors in the aroma biosynthesis (lipoxygenase and alcohol dehydrogenase). Several proteins with possible chromoplastic location were coupled with the GFP and expressed in the single cell system. A protocol for isolating tomato fruit chloroplasts and immature chromoplasts was described along with the characterization of the plastidial fractions by confocal microscopy. The transition of the chloroplast to chromoplast is a process that was never described by means of proteomics. This work answers some questions regarding the changes that take place in the organelle, and brings novel information for the understanding of fruit ripening process