Thèse soutenue

Expression hétérologue, repliement in-vitro et caractérisation biophysique du domaine N-terminal de la sous-unité T1R3 du récepteur au goût sucré

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Auteur / Autrice : Elodie Maitrepierre
Direction : Loïc Briand
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie
Date : Soutenance le 16/12/2010
Etablissement(s) : Dijon
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale E2S Environnements, Santé, STIC (Dijon ; ....-2012)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation (Dijon ; 2010-....)
Jury : Président / Présidente : Norbert Latruffe
Examinateurs / Examinatrices : Yves Artur
Rapporteurs / Rapporteuses : Roland Salesse, Emmanuelle Jacquin-Joly

Résumé

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Le récepteur au goût sucré est un hétérodimère composé de 2 sous-unités appelées T1R2 et T1R3. Chaque sous-unité appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G de la classe C. Les membres de cette famille de récepteurs partagent une architecture commune, constituée d’un domaine N-terminal (DNT) de grande taille lié au domaine transmembranaire par une région riche en cystéine. Il a été montré que les DNT de T1R2 et T1R3 de souris étaient capables de lier des sucres naturels (saccharose et glucose) et le sucralose, avec des affinités distinctes et avec différents changements de conformation du domaine induits la fixation du ligand (Nie et al., Curr Biol, 2005). Cependant, les propriétés de liaison du DNT de T1R3 humain, ainsi que la contribution respective des 2 sous-unités dans la fonctionnalité du récepteur restent encore largement méconnues. Lors de cette étude, nous avons exprimé les DNT de T1R3 humain (DNT-hT1R3) et de souris à l’aide de la bactérie Escherichia coli, sous forme de protéines insolubles, appelés corps d’inclusion (CI). Les CI ont été purifiés puis solubilisés en utilisant un agent chaotrope. Le transfert des DNT dans leur état natif par un repliement in vitro, nécessite un criblage des conditions de repliement. Pour cela nous avons utilisé une approche factorielle en faisant varier des facteurs tels que le tampon, le pH ou la présence d’additifs. Les protéines repliées ont ensuite été caractérisées par différentes approches parmi lesquelles l’électrophorèse, la filtration sur gel, la fluorescence et le dichroïsme circulaire. Leur fonctionnalité a ensuite été vérifiée en mesurant les variations de l’intensité de fluorescence intrinsèque des protéines engendrées par l’ajout de sucralose. Le dosage d’Ellman a permis de déterminer la présence d’une seule cystéine libre dans DNT-hT1R3, qui a été confirmée, par purification, puis analyse des peptides trypsiques de la protéine. La présence de structures secondaires a été montrée par dichroïsme circulaire. Afin de caractériser les propriétés de liaison de DNT-hT1R3, un marquage fluorescent a été réalisé en utilisant une sonde sensible à l’environnement greffée de manière covalente à la protéine. Nous avons montré que la fixation d’un ligand sur la protéine marquée provoque des modifications conformationnelles qui ont permis de mesurer l’affinité du DNT de T1R3 pour diverses molécules sapides, avec des affinités en accord avec les données sensorielles. Cette étude a également permis de montrer que le calcium et le magnésium étaient capables de se lier à la protéine. Enfin, les propriétés de liaison de certains ligands ont été validées par microcalorimétrie. Ces résultats montrent que le DNT de T1R3 joue un rôle important, jusqu’à présent insoupçonné dans la reconnaissance des composés sucrés.