Développement d’outils moléculaires pour l’exploration fonctionnelle de Oenococcus oeni : une bactérie d’intérêt oenologique

Development of genetic tools for the gene exploration in Oenococcus oeni : a bacterium of oenological interest

• Auteur / Autrice : Juan Simon Assad Garcia
• Direction : Jean Guzzo, Cosette Grandvalet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de l'alimentation. Microbiologie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Dijon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fermentation malolactique

Vinification

Oenococcus oeni

Lactobacillaceae

Résumé

Oenococcus oeni est une bactérie lactique impliquée dans la fermentation malolactique (FML) des vins. L’initiation de la FML liée à la croissance de O. Oeni, reste une des étapes la moins bien maîtrisée lors de la vinification du fait des stress imposés par le moût fermenté. L’optimisation des levains malolactiques nécessite l’étude des mécanismes cellulaires mis en jeu au cours de l’adaptation de O. Oeni en milieu vin. Ainsi, la mutagenèse dirigée apparaît indispensable pour étudier in situ ces mécanismes. L’utilisation de vecteurs suicides nécessitant une technique de transfert génétique de fréquence optimale, une amélioration des techniques existantes a été recherchée. L’optimisation de la conjugaison du vecteur pGID052 entre L. Lactis et O. Oeni a été appréhendée par l’application de diverses conditions visant à perturber les barrières du transfert génétique. Le taux de transfert a été amélioré en maintenant les partenaires de conjugaison à 40°C (10 fois) ou par addition de concentrations sub-létales d’érythromycine (7 fois). Une technique de transfert génétique par électroporation a également été développée pour cette bactérie antérieurement réfractaire à cette méthode. L’ajout d’éthanol dans le tampon d’électroporation en tant qu’agent fluidifiant membranaire a été nécessaire pour l’obtention de transformants. A l’aide de cette technique, nous avons introduit un gène tronqué chez O. Oeni détectant pour la première fois le produit de son expression. En parallèle, une étude transcriptionnelle du gène cfa de O. Oeni a été réalisée. Cette étude a permis de caractériser la région promotrice de ce gène et montre qu’il est sous le contrôle d’un seul facteur sigma.

Oenococcus oeni is a lactic acid bacterium mostly responsible for malolactic fermentation (MLF) in wine. Because MLF occurs in the fermented grape must, which is a hostile environment, its control is a critical component of winemaking. Improvement of malolactic starters requires the study of the stress response in O. Oeni. Thus, gene knockout is indispensable for the in situ study of these responses. Because genetic tools such as integrative vectors require a maximal genetic transfer rate, we tried to optimise the genetic transfer by conjugation from L. Lactis to O. Oeni using pGID052 vector. We tested several conditions to disturb the barriers to the introduction of foreign DNA. We observed that sub lethal concentrations of erythromycin in the mating medium resulted in an increased conjugation rate (7-fold). When mating conditions where imposed at 40°C, the conjugation rate was also increased (10-fold). Moreover, an electroporation procedure was developed for this bacterium previously refractory to this method. The main improvement was the addition of ethanol to the electroporation buffer as a membrane fluidizing agent. Using our technique we introduced a recombinant vector and detected the production of the corresponding protein. A transcriptional study of the cfa gene was also achieved. Our findings show that the regulation of the transcription of this gene is under the control of only one sigma factor.