Etude de l'état métabolique des levures en fermentation alcoolique: mise au point de descripteurs pour une caractérisation rapide

Flow cytometric assessment of viable yeast cells for the early discrimination of alcoholic fermentation behaviour in oenological conditions

• Auteur / Autrice : Jean-Christophe Bouchez
• Direction : Francis Duchiron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences:Microbiologie industrielle
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Reims

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vinification

Microorganismes -- Croissance

Cytométrie de flux

Levure (agent de fermentation)

Fermentation acétonobutylique

Mots clés libres

Saccharomyces, growth kinetic, ethanol, physiology, fermentation, yeast viability, flow cytometry, histogram treatment

Résumé

Les levures sont largement employées en vinification, notamment pour la production de Champagne, dont la constance et la qualité sont directement conditionnées par l'état physiologique des ferments ensemencés. S'il était possible, pour les producteurs, de mesurer la viabilité et/ou la vitalité des levures rapidement et efficacement, ils pourraient alors prendre des mesures préventives adéquates, en début de fermentation, pour éviter les arrêts inopportuns souvent rencontrés. Cette étude porte sur une méthode prometteuse susceptible de détecter un tel risque, de manière suffisamment précoce pour autoriser un traitement préventif adéquate. La méthode est basée sur la mesure, par cytométrie en flux, de la viabilité des levures marquées par des fluorochromes (dérivé de la fluorescéine et oxonol). L'évolution de la distribution cytométrique révèle la dynamique comportementale des levures viables et dépolarisées au cours de fermentations normales, languissantes ou arrêtées (causées par une température élevée, une carence azotée ou la persistance de résidus inhibiteurs dans le moût), associée à la diversité des états physiologiques rencontrés dans ces différentes conditions. La méthode des descripteurs de l'histogramme cytométrique a été développée afin de pouvoir associer chaque comportement fermentaire à une signature cytométrique spécifique. En établissant, à l'aide d'une programme développé dans le cadre de cette étude, une combinaison des trois descripteurs de cet histogramme, il est alors possible, quelle que soit la concentration en éthanol atteinte, le moût considéré ou la souche utilisée, de diagnostiquer de manière fiable et rapide, un éventuel risque fermentaire.

Viable preparations of yeasts are widely employed in the wine industry, particularly for the production of Champagne. Its consistency and quality may be directly influenced by their physiological state, and if it were possible to measure yeast viability and/or vitality rapidly and accurately, producers would then be able to take corrective action at the beginning of fermentation. This study describes a new method for the early detection of alcoholic fermentation arrest. This methodology is based on the flow cytometric assessment of S. Cerevisiae yeasts stained with two fluorescent viability probes (fluorescein and oxonol derivatives). The evolution of flow cytometric distribution reveals dynamic changes in heterogeneous populations of viable and depolarized cells which can be explained by cellular physiological diversity occurring throughout the process during normal, sluggish or arrested fermentations caused by an elevated temperature (model), a nitrogen deficiency or the persistence of pesticide residues in the must (oenological conditions). The histogram descriptor method has been developed in order to extract relevant parameters from the fluorescence distributions, the aim being to associate, quickly and simply, each histogram shape signature with a particular fermentation behavior. Each descriptor profile was plotted as a function of the ethanol concentration. The combinations of three particular descriptors resulting from an experimental distribution could be compared with a theoretical database and suggest a probability of whether the fermentation would be normal or not, very early in the process whatever the medium composition and probably the strain inoculated as the two Champagne strains for the different musts tested showed the same combinations.